分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-10-09 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：构建噬菌体天然纳米抗体展示库，以期用于筛选不同抗原分子的纳米抗体筛选平台，并用艰难梭菌谷氨酸脱氢酶（GDH）抗原筛选靶向GDH的纳米抗体，对所构建的噬菌体天然纳米抗体展示库进行验证。 方法：采用Oligo DT提取双峰骆驼脾脏总RNA进行反转录，通过巢氏PCR获取全套重链可变区基因，将其构建到噬菌粒pCANTAB5E载体，经多次电转化至E.coil TG1 构建初级噬菌体抗体库，经辅助噬菌体拯救后构成噬菌体展示库，并对噬菌体展示库的库容及多样性进行分析和鉴定。同时以GDH为靶向抗原对文库进行淘筛，计算淘筛回收率，并对第三轮淘筛后平板的单克隆进行ELISA鉴定。 结果：构建的天然噬菌体纳米抗体库的插入率为95%左右，随机挑取的9个克隆氨基酸同源性为66.17%，经MEGA分析后具有较好的多样性，同时经辅助噬菌体拯救后，得到的噬菌体展示库滴度为4×1012 CFU/ml。在三轮淘筛过程中，回收率逐步升高，噬菌体得到了有效的富集，同时对阳性克隆进行测序及分析，最终得到2条抗GDH纳米抗体序列。结论：成功构建了双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示文库且多样性良好，为后续筛选其他的靶向抗原奠定了基础，同时筛选获得两条抗GDH纳米抗体序列，为制备艰难梭菌谷氨酸脱氢酶诊断抗体提供技术支撑。
分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-07 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的 探讨GSK-3β对小鼠骨髓树突状细胞（BMDC）成熟和功能的调控作用。方法 脂多糖催熟BMDC，Western blotting检测刺激前后糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的磷酸化水平的改变；利用GSK-3β的选择性抑制剂SB216763处理BMDC，检测表型、细胞因子表达和混合淋巴反应（MLR）的变化情况；构建过表达小鼠GSK-3β的慢病毒载体并转染DC2.4细胞，Westernblotting检测过表达GSK-3β对调控树突状细胞（DC）成熟的关键调控因子鸟的网状内皮组织增生病毒癌基因相关B（RelB）蛋白水平的影响。结果 经脂多糖处理后，GSK-3βY216磷酸化水平下调，Ser9磷酸化水平显著上调，表明GSK-3β的活性显著下降。抑制GSK-3β的活性能上调DC表面共刺激分子CD40和CD86的表达，削弱脂多糖诱导的促炎细胞因子IL-6和IL-12表达上调，而对抗炎细胞因子IL-10的表达有促进作用，同时降低脂多糖诱导成熟的DC刺激同种异基因T细胞增殖的能力。在未成熟的DC2.4细胞中，过表达GSK-3β能够下调RelB的水平。结论 GSK-3β参与调控DC的成熟和功能，高活性的GSK-3β抑制未成熟树突状细胞（iDC）的自发性成熟，GSK-3β失活后促进DC表型的成熟，而在脂多糖诱导DC分化的过程中GSK-3β发挥促炎作用。GSK-3β能够下调RelB的蛋白水平，有望成为构建新型耐受性DC的新靶点。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 【目的】 通过研究miR-17-5p对自噬相关基因ATG7的靶向调控机制和对细胞自噬的作用，探究miR-17-5p在结核分枝杆菌介导的自噬途径中的作用及其机制。【方法】 生物信息学分析得到miR17-5p的靶基因ATG7，通过成功构建载体ATG7野生型（pMirGLO-ATG7-3'UTR-WT）和突变型，利用双荧光素酶报告系统、Western blot验证miR-17-5p和ATG7的靶向关系，同时构建结核分枝杆菌（H37Ra）感染的人源性THP-1巨噬细胞模型，将做不同处理的细胞分为三组：miR-17-5p mimics，miR-17-5p inhibitor，miR-17-5p nc。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测H37Ra感染对miR-17-5p表达量的影响，并且进一步通过Western blot、免疫荧光观察检测LC3蛋白的表达量和自噬小体的数量。【结果】 MTB感染能够引起miR-17-5p的下调，随着感染复数的增加有明显的降低。而生物信息学预测结果显示miR-17-5p与ATG7具有靶向性，双荧光素酶报告实验、Western blot验证miR-17-5p能够和ATG7靶向结合，并对其进行负调控。进一步通过Western blot，免疫荧光观察发现miR-17-5p mimics组LC3Ⅱ的表达下调，自噬小体表达降低，而miR-17-5p inhibitor组相反。其中对H37Ra感染组与未感染组之间比较，ATG7和LC3Ⅱ蛋白表达明显增强。【结论】 miR-17-5p直接靶向结合ATG7 3'UTR抑制自噬，在巨噬细胞抗MTB过程中发挥作用。
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