基于慢病毒系统的双荧光标记多功能自噬流监测系统建立与应用

摘要: 目的 构建能够用于稳定动态监测细胞自噬流变化和过表达基因的红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-鼠源LC3融合慢病毒多功能表达载体(PCDH-Duo-mRFP-eGFPph-LC3rat，PCDH-Duo) , 并构建小鼠腹腔巨噬细胞Raw264.7稳转株观察自噬流变化。方法 应用基于PCR精确合成mRFP-eGFPph-LC3rat融合全基因，将其克隆至慢病毒表达载体PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP中，重组质粒经菌落PCR、酶切及测序分析正确无误后, 包装慢病毒，转染Raw264.7细胞，并利用流式分选术获取稳转株，经氯喹抑制自噬模型及Western blotting鉴定eGFP蛋白表达确认其可靠性。结果 成功构建了PCDH-Duo重组慢病毒质粒，包被慢病毒并获得Raw264.7稳定细胞系(Raw264.7-PCDH-Duo)，可稳定表达双荧光蛋白，经3 mM氯喹作用6h后，能够稳定准确指示自噬流变化。结论 成功构建了基于慢病毒系统的双荧光标记多功能自噬流监测系统，为研究细胞自噬与编码基因及非编码基因之间的关系提供了方便有力的工具。