分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 金黄色葡萄球菌是一类重要的病原菌，其毒力因子的表达及分泌过程由多种双组份信号转导系统（two component signal transduction system, TCSTS）共同调控，其中ArlRS双组份信号转导系统与细菌的生长和分裂密切相关。ArlRS双组份系统的信号传递通过组氨酸激酶ArlS磷酸化实现,ArlS的胞内域被认为是调控毒力因子表达的重要功能域, 本文以ArlS蛋白的胞内域部分即ArlSCA为目标蛋白进行相关的活性研究。首先构建pProEX-HTa-arls和pProEX-HTa-arlr重组质粒，对目的蛋白进行诱导表达。其次，利用金属离子螯合层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析方法对目的蛋白进行分离纯化，纯化后的ArlR蛋白纯度可达98%，产量约为25 mg/L；纯化后的ArlS蛋白纯度可达90%，产量约为15 mg/L。圆二色谱检测结果显示纯化后的目的蛋白有完整的二级结构具有激酶活性。体外磷酸化结果显示，ArlS蛋白自磷酸化后可以将磷酸基团转移给反应调控蛋白ArlR。最后，利用定点突变的方法，构建了418位和420位氨基酸残基突变的表达载体pProEX-HTa-ArlSCAG418A和pProEX-HTa-ArlSCAG420A。ArlSCAG418A和ArlSCAG420A蛋白不具有激酶活性，说明418位和420位氨基酸残基在ArlS蛋白的自磷酸过程中起着关键作用。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 金黄色葡萄球菌是一类重要的病原菌，其毒力因子的表达及分泌过程由多种双组份信号转导系统（two component signal transduction system, TCSTS）共同调控，其中ArlRS双组份信号转导系统与细菌的生长和分裂密切相关。ArlRS双组份系统的信号传递通过组氨酸激酶ArlS磷酸化实现,ArlS的胞内域被认为是调控毒力因子表达的重要功能域, 本文以ArlS蛋白的胞内域部分即ArlSCA为目标蛋白进行相关的活性研究。首先构建pProEX-HTa-arls和pProEX-HTa-arlr重组质粒，对目的蛋白进行诱导表达。其次，利用金属离子螯合层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析方法对目的蛋白进行分离纯化，纯化后的ArlR蛋白纯度可达98%，产量约为25 mg/L；纯化后的ArlS蛋白纯度可达90%，产量约为15 mg/L。圆二色谱检测结果显示纯化后的目的蛋白有完整的二级结构具有激酶活性。体外磷酸化结果显示，ArlS蛋白自磷酸化后可以将磷酸基团转移给反应调控蛋白ArlR。最后，利用定点突变的方法，构建了418位和420位氨基酸残基突变的表达载体pProEX-HTa-ArlSCAG418A和pProEX-HTa-ArlSCAG420A。ArlSCAG418A和ArlSCAG420A蛋白不具有激酶活性，说明418位和420位氨基酸残基在ArlS蛋白的自磷酸过程中起着关键作用。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 金黄色葡萄球菌是一类重要的病原菌，其毒力因子的表达及分泌过程由多种双组份信号转导系统（two component signal transduction system, TCSTS）共同调控，其中ArlRS双组份信号转导系统与细菌的生长和分裂密切相关。ArlRS双组份系统的信号传递通过组氨酸激酶ArlS磷酸化实现,ArlS的胞内域被认为是调控毒力因子表达的重要功能域, 本文以ArlS蛋白的胞内域部分即ArlSCA为目标蛋白进行相关的活性研究。首先构建pProEX-HTa-arls和pProEX-HTa-arlr重组质粒，对目的蛋白进行诱导表达。其次，利用金属离子螯合层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析方法对目的蛋白进行分离纯化，纯化后的ArlR蛋白纯度可达98%，产量约为25 mg/L；纯化后的ArlS蛋白纯度可达90%，产量约为15 mg/L。圆二色谱检测结果显示纯化后的目的蛋白有完整的二级结构具有激酶活性。体外磷酸化结果显示，ArlS蛋白自磷酸化后可以将磷酸基团转移给反应调控蛋白ArlR。最后，利用定点突变的方法，构建了418位和420位氨基酸残基突变的表达载体pProEX-HTa-ArlSCAG418A和pProEX-HTa-ArlSCAG420A。ArlSCAG418A和ArlSCAG420A蛋白不具有激酶活性，说明418位和420位氨基酸残基在ArlS蛋白的自磷酸过程中起着关键作用。
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