分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-10-15 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： Kex2蛋白酶是一种来源于酵母的前体加工蛋白酶。本研究利用毕赤酵母(Pichia pastoris)同源表达来源于毕赤酵母的Kex2蛋白酶(PPKex2)，研究其表达特性和酶学性质，同时与毕赤酵母表达的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Kex2蛋白酶(SCKex2)进行比较。首先，分别从毕赤酵母和酿酒酵母基因组中获得Kex2基因，将其插入到表达载体pPIC9K中，并转化毕赤酵母菌株GS115。重组菌株经甲醇诱导表达后，结果表明PPKex2的发酵上清液比活是SCKex2的7倍。Kex2蛋白酶经Q-FF强阴离子交换柱纯化后进行酶学性质研究。酶学性质研究结果表明，PPKex2的最适反应pH是8.0-9.0，最适反应温度是37 ℃，与SCKex2性质相近。在稳定性方面，PPKex2在pH 7.0时最稳定，在碱性条件下的稳定性高于SCKex2，在酸性条件下的稳定性低于SCKex2，另外PPKex2的温度稳定性略低于SCKex2。酶促反应动力学研究表明，PPKex2的kcat和kcat/Km值分别为SCKex2的4.8和3.3倍。本文首次报道了同源表达毕赤酵母Kex2蛋白酶的表达特性及酶学性质，为其今后的研究及应用奠定了基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-03-22 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 胆固醇氧化酶专一性地催化胆固醇为胆甾-4-烯-3-酮，广泛地应用于临床以及食品加工行业。本论文将来源于Pimelobacter simplex的胆固醇氧化酶PsCO4，分别转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，在不同温度（15 ℃、25 ℃、37 ℃）及IPTG诱导浓度（0.01 mM、 0.1 mM、0.5 mM）下异源表达PsCO4。结果表明，转入Rosetta(DE3)菌株的PsCO4蛋白，在IPTG浓度为0.1 mM、15 ℃下经18 h诱导表达，PsCO4可溶性表达量最高(0.63 mg/ml)。异源表达的胆固醇氧化酶PsCO4最适温度为30 ℃，最适pH为7.5。通过TLC, GC-MS检测出PsCO4催化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮。以胆固醇和β-谷甾醇、豆甾醇和孕烯醇酮为底物，测定PsCO4对四种底物的催化反应动力学参数，胆固醇kcat /Km 为0.08 s-1·M-1分别高于β-谷甾醇(0.04 s-1·M-1)、豆甾醇(0.005s-1·M-1)和孕烯醇酮(0.02 s-1·M-1)。
分类： 生物学 >> 动物学 提交时间： 2017-11-07 合作期刊: 《动物营养学报》
摘要： 本试验旨在构建不同纤维素酶的融合表达系统及探讨融合纤维素酶的酶学性质。利用PCR技术从实验室前期分离的枯草芽孢杆菌中分别扩增2个纤维素酶基因Cel42和Cel22，设计一段柔性接头（GSGGGS），通过酶切连接将2个纤维素酶基因构建在一个开放阅读框（ORF）内，插入到pET32a(+)中构建重组表达载体pET32a(+)-Cel42-Cel22，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，并对其酶学性质进行研究。结果表明：本试验成功克隆了2个纤维素酶基因Cel42和Cel22，并构建了重组表达系统BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)估计其分子质量约为101 ku，粗酶液中葡聚糖内切酶活性为57.62 U/mL，葡聚糖外切酶活性为32.57 U/mL。试验所得融合纤维素酶Cel42-Cel22的最适反应温度为50 ℃，最适反应pH为6.0，温度在30～70 ℃范围内时可维持70%以上的纤维素酶活性，pH在4.0～9.0范围内时可保持75%以上的纤维素酶活性。除Mn2+外，其他金属离子对纤维素酶的活性均具有一定的抑制作用，其中Hg2+和Cu2+对的抑制作用较明显。由此可见，本试验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了融合纤维素酶Cel42-Cel22，且该酶具有一定的活性，可适应较宽广的温度和pH范围，对金属离子敏感。
分类： 生物学 >> 动物学 提交时间： 2017-10-11 合作期刊: 《动物营养学报》
摘要： 本试验旨在构建不同纤维素酶的融合表达系统及探讨融合纤维素酶的酶学性质。利用PCR技术从实验室前期分离的枯草芽孢杆菌中分别扩增2个纤维素酶基因Cel42和Cel22，设计一段柔性接头（GSGGGS），通过酶切连接将2个纤维素酶基因构建在一个开放阅读框（ORF）内，插入到pET32a(+)中构建重组表达载体pET32a(+)-Cel42-Cel22，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，并对其酶学性质进行研究。结果表明：本试验成功克隆了2个纤维素酶基因Cel42和Cel22，并构建了重组表达系统BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)估计其分子质量约为101 ku，粗酶液中葡聚糖内切酶活性为57.62 U/mL，葡聚糖外切酶活性为32.57 U/mL。试验所得融合纤维素酶Cel42-Cel22的最适反应温度为50 ℃，最适反应pH为6.0，温度在30～70 ℃范围内时可维持70%以上的纤维素酶活性，pH在4.0～9.0范围内时可保持75%以上的纤维素酶活性。除Mn2+外，其他金属离子对纤维素酶的活性均具有一定的抑制作用，其中Hg2+和Cu2+对的抑制作用较明显。由此可见，本试验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了融合纤维素酶Cel42-Cel22，且该酶具有一定的活性，可适应较宽广的温度和pH范围，对金属离子敏感。
分类： 生物学 >> 动物学 提交时间： 2017-10-11 合作期刊: 《动物营养学报》
摘要： 本试验旨在通过角质降解菌株X8P的种属鉴定、发酵条件优化和酶学性质研究，探讨降解植物表面角质层，进一步改善动物对植物纤维利用的可能新方案。试验通过形态观察和16S rDNA测序鉴定菌株X8P种属，并对其产酶所需碳源、氮源、发酵温度与时间进行优化，其发酵液经硫酸铵盐析沉淀获得其胞外蛋白粗酶，并对其粗酶催化的适宜pH和pH稳定性、温度和温度稳定性，以及有机溶剂、表面活性剂和金属离子对其活性的影响进行研究。结果表明：1）菌株X8P经形态观察和分子鉴定为东方醋杆菌（Acetobacter orientalis）。2）菌株X8P适宜产酶发酵条件为溶菌肉汤（LB）培养基中37 ℃发酵4 d，1%橄榄油和1%葡萄糖明显促进菌株产酶，而1%可溶性淀粉明显抑制菌株产酶。3）该菌株胞外粗酶催化适宜pH和温度分别为6.5和45 ℃，且表现出一定pH稳定性，但在有机溶剂中不稳定，仅甘油中可保留全部活性，在二甲基亚砜（50%）中活性可保留66%。吐温（Tween）-20（1 mmol/L）、Tween-80（1 mmol/L）和聚乙二醇辛基苯基醚（1和10 mmol/L）可使菌株X8P粗酶活性提高3%~35%。金属离子钾离子(K+)、锰离子（Mn2+）（1和10 mmol/L）可使菌株X8P粗酶活性提高2%~20%。由此可见，菌株X8P具有一定的产角质酶潜力和应用前景，可进一步深入研究。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-12-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 为了实现糖苷类物质的高效转化，将来源于副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）TK1501β-葡萄糖苷酶基因连接于表达载体pET28a(+)上，在E. coli BL21中表达，重组酶经镍离子亲和层析分离得到纯酶，其相对分子量和比酶活分别为86.63 kDa和675.56 U/mg。最适作用温度和pH分别为30 ℃和6.5。 Mg2+和Ca2+对β-葡萄糖苷酶酶活抑制作用最小，Cu2+几乎使其丧失催化活性。其底物特异性较宽泛，对大豆异黄酮、栀子苷、水杨苷、七叶苷、虎杖苷、熊果苷均有降解作用。以β-pNPG为底物时，该酶的Km和Vmax分别为1.44 mM和58.32 mM s-1，催化系数kcat为3982 s-1。结果与分析表明来源于副干酪乳杆菌TK1501β-葡萄糖苷酶对水解大豆异黄酮和合成糖苷将会发挥重要作用。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-15 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 根据信号肽N端电荷数，选择Sec及Tat两种途径的信号肽构建枯草芽孢杆菌穿梭质粒，首次实现Bacillus cereus源亮氨酸脱氢酶基因在Bacillus subtilis中的分泌表达。Tat途径信号肽PhoD促进蛋白分泌的效果最好，胞外酶活力达20.25U/ml，为不添加信号肽的2.2倍，信号肽N端较多的电荷数，可能有利于多聚体蛋白的分泌。对表达产物进行纯化和酶学性质测定。结果表明，纯酶比酶活为13U/mg；L-Leucine为底物时酶的Km为6.17mM，Vmax为14.49umol·min-1·mg-1；底物特异性研究发现，酶与天然底物L-Leucine的亲和性最好，对一些脂肪族氨基酸也有活性，对芳香族氨基酸L-Phenylalanine无活性；酶的最适pH为10.5~12，pH稳定范围为5.0-11.0；最适反应温度为55℃；圆二色谱变温扫描酶二级结构变化，α螺旋含量随温度升高逐渐降低；差示扫描微量热技术(DSC)测定酶的解折叠温度（Tm值）为64.13℃，表明该酶具有较好耐热性。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-04-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440中的6-羟基烟酸（6HNA）3-单加氧酶（NicC）是烟酸代谢过程中的关键酶。NicC通过在吡啶环上加羟基对吡啶环进行了活化，从而使得吡啶环可在双加氧酶催化下开环最终被完全降解。本研究通过去除NicC的N端稀有密码子增加了NicC的表达量，进一步利用Ni-Sepharose重力柱对NicC进行了纯化。通过实验发现，NicC的最适反应温度为30℃-40℃，最适反应pH为8.0。Cd2+离子对于NicC的酶活有明显的抑制作用。当NADH的浓度为0.25 mM的时候，底物6HNA所对应的NicC的最大酶活为14.1 U/mg，Km值为51.8 μM；当6HNA的浓度为0.25 mM的时候，底物NADH所对应的NicC的最大酶活为10.79 U/mg，Km值为15.0 μM。通过HPLC和LC-MS分析表明，NicC可以在NADH和氧气的参与下催化6HNA转化生成2,5-二羟基吡啶（2,5-DHP）和甲酸，另外可以将对羟基苯甲酸转化生成对苯二酚。同位素标记实验表明产物2,5-DHP中的氧原子来源于参与反应的氧气。该研究为研究吡啶类化合物微生物代谢提供了理论基础。
点击量
点击量
下载量
评论
