分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： SUMO蛋白酶（Ulp1）是切割小分子泛素修饰（SUMO）融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶，具有酶切效率高，特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵，操作复杂，限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术，合成基因ulp1（Leu403-Lys621），并在N端和C端加入多聚组氨酸标签（His6），构建重组表达载体psvT7-ulp1，将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21 trxB(DE3)中。经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21(DE3)作为表达宿主，转接后7 h加入IPTG，IPTG的终浓度为0.1 mmol/L，诱导时间为16 h，最终蛋白表达量占菌体总蛋白的34.5%，重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L，通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。通过酶切反应，测定酶活为5.19 U/μl，比酶活为5.23×104 U/mg，是先前报道比酶活的1.87倍，通过酶活动力学分析，Ulp1的表观米氏常数 Km=0.359 g/L，Vm=5.10μg/(mL·min)。将SUMO融合表达体系用于单链抗体（Single-Chain Antibody Fragment，scFv）的表达，得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白，使用表达的Ulp1进行酶切并纯化，获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv,操作步骤简单，显著改善了scFv在大肠杆菌中难于高效可溶性表达纯化的现状。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-08-29 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：建立一种高效噬菌体文库构建方法，获得抗鸡卵清蛋白（ovalbumin, OVA）的单链抗体（scFv）噬菌体展示文库，筛选鉴定获得OVA单链抗体。方法：用OVA蛋白免疫Balb/C小鼠，选取血清抗体效价高的小鼠提取脾脏RNA，利用RT-PCR方法扩增获得小鼠重链和小鼠轻链基因。通过无缝连接酶一步将小鼠重链基因、轻链基因和linker DNA连接起来，插入噬菌体表达载体中，构建OVA scFv噬菌体展示文库。测定文库容量，对文库进行富集筛选，ELISA鉴定阳性克隆，测序后构建真核表达载体，转入Expi-CHO悬浮细胞进行真核表达，利用Western blot进行鉴定。结果：成功获得库容量为1.2×107cfu的OVA scFv噬菌体展示文库，并从中筛选出8个阳性克隆，选取效价最高的2号克隆，在Expi-CHO悬浮细胞中表达获得可溶性抗体。结论：本研究建立了一种高效构建scFv噬菌体文库的方法，筛选获得高结合活性的OVA单链抗体，并成功进行了真核表达，为OVA ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。
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