分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：以c-Myc-GST蛋白为靶分子，从纳米抗体噬菌体展示免疫文库中筛选能够特异性识别c-Myc标签（EQKLISEEDL）的纳米抗体。方法：采用固相淘选技术，筛选出能与c-Myc标签特异性结合的噬菌体，phage-ELISA鉴定阳性克隆并测序，通过基因重组技术将阳性噬菌体编码的纳米抗体基因克隆至原核表达载体pET25b（+），转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。采用间接ELISA和量子点免疫荧光法验证纳米抗体的结合活性和特异性。结果：通过4轮固相淘选，具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集，回收率提高了145倍，阳性率从20.83%提高至85.4%。将phage-ELISA鉴定显色值高的两个纳米抗体A25和A26分别进行了重组表达，SDS-PAGE结果显示均为可溶性表达，表达量为60 mg/L。间接ELISA结果表明重组蛋白A25和A26都能够识别c-Myc标签，量子点免疫荧光法验证得到纳米抗体A25能够对SP2/0细胞内的c-Myc蛋白进行检测。结论：成功地筛选出与c-Myc标签结合的纳米抗体噬菌体克隆，构建了两个抗c-Myc标签纳米抗体的原核表达载体并实现了可溶性表达，为检测胞内c-Myc蛋白奠定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：以c-Myc-GST蛋白为靶分子，从纳米抗体噬菌体展示免疫文库中筛选能够特异性识别c-Myc标签（EQKLISEEDL）的纳米抗体。方法：采用固相淘选技术，筛选出能与c-Myc标签特异性结合的噬菌体，phage-ELISA鉴定阳性克隆并测序，通过基因重组技术将阳性噬菌体编码的纳米抗体基因克隆至原核表达载体pET25b（+），转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。采用间接ELISA和量子点免疫荧光法验证纳米抗体的结合活性和特异性。结果：通过4轮固相淘选，具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集，回收率提高了145倍，阳性率从20.83%提高至85.4%。将phage-ELISA鉴定显色值高的两个纳米抗体A25和A26分别进行了重组表达，SDS-PAGE结果显示均为可溶性表达，表达量为60 mg/L。间接ELISA结果表明重组蛋白A25和A26都能够识别c-Myc标签，量子点免疫荧光法验证得到纳米抗体A25能够对SP2/0细胞内的c-Myc蛋白进行检测。结论：成功地筛选出与c-Myc标签结合的纳米抗体噬菌体克隆，构建了两个抗c-Myc标签纳米抗体的原核表达载体并实现了可溶性表达，为检测胞内c-Myc蛋白奠定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-25 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 猪支原体肺炎（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是由猪肺炎支原体引起的一种存在于世界各地的严重危害养猪业的疾病，严重影响饲料报酬，造成巨大的经济损失。准确、敏感、快速的Mhp检测方法有助于了解Mhp在猪群的流行情况，进而采取相应的预防、治疗和综合防控措施。本文对国内外Mhp病原学、分子生物学和免疫学检测方法进行了综述，为科技工作者全面了解Mhp检测方法提供了参考资料。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的 制备抗埃博拉病毒核蛋白（EBOV NP）单克隆抗体和多克隆抗体，建立针对EBOV NP的ELISA检测方法。方法 以重组EBOV NP免疫动物并制备多克隆抗体和单克隆抗体。在此基础上，通过优化抗体浓度、包被液等条件建立检测EBOV NP的双抗夹心ELISA方法。结果 制备出了兔多克隆抗体，筛选出2株可分泌单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株。Western Blot实验结果表明兔多抗与鼠单抗的结合区域均为N端1~35氨基酸。通过优化，建立了针对EBOV NP的双抗夹心ELISA检测方法。其线性范围是31.2 -1000 ng/mL，最低检测限为2.6 ng/mL。结论 制备出了抗EBOV核蛋白的高特异性多克隆抗体和单克隆抗体，建立了定量检测EBOV核蛋白的方法。
分类： 生物学 >> 生物物理学 >> 生物物理、生物化学与分子生物学 提交时间： 2016-05-11
摘要： Isoenzyme c of horseradish peroxidase (HRP-C) is widely used in enzyme immunoassay combined with chemiluminescence (CL) detection. For this application, HRP-C activity measurement is usually based on luminol oxidation in the presence of hydrogen peroxide (H2O2). However, this catalysis reaction was enhancer dependent. In this study, we demonstrated that Jatropha curcas peroxidase (JcGP1) showed high efficiency in catalyzing luminol oxidation in the presence of H2O2. Compared with HRP-C, the JcGP1-induced reaction was enhancer independent, which made the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) simpler. In addition, the JcGP1 catalyzed reaction showed a long-term stable CL signal. We optimized the conditions for JcGP1 catalysis and determined the favorable conditions as follows: 50 mM Tris buffer (pH 8.2) containing 10 mM H2O2, 14 mM luminol and 0.75 M NaCl. The optimum catalysis temperature was 30 degrees C. The detection limit of JcGP1 under optimum condition was 0.2 pM. Long-term stable CL signal combined with enhancer-independent property indicated that JcGP1 might be a valuable candidate peroxidase for clinical diagnosis and enzyme immunoassay with CL detection. Copyright (C) 2014 John Wiley & Sons, Ltd.
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