分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 为了延长重组睫状神经营养因子在体内的保留半衰期，基于CNTF中天然的游离半胱氨酸残基，前期工作中我们采用聚乙二醇修饰和转铁蛋白偶联的两种方式对CNTF进行改造。本研究中我们采用常规分析手段对PEG20k-CNTF和Tf-PEG5k-CNTF进行对比表征。高效凝胶过滤和动态光散射分析结果显示两者拥有相近的表观分子体积。细胞试验结果显示两种耦合物的活性分别下降至未修饰CNTF的50.6%和65.8%。抗体CNTF抗体亲和力结果显示PEG20k修饰后亲合力下降至原蛋白的3.8%，转铁蛋白偶联后保留89.9%原蛋白亲合力。药代动力学结果显示PEG20k-CNTF和Tf-PEG5k-CNTF在SD大鼠血液中的保留半衰期分别为5.34 ± 0.26和8.65 ± 0.60小时，与未修饰rhCNTF相比延长了约21.4倍和34.6倍。药效学结果显示在每周两次每次1.0 mg/kg （rhCNTF等量）的给药频率和剂量，PEG20k-CNTF比Tf-PEG5k-CNTF更显著地降低实验小鼠体重。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 为了延长重组睫状神经营养因子在体内的保留半衰期，基于CNTF中天然的游离半胱氨酸残基，前期工作中我们采用聚乙二醇修饰和转铁蛋白偶联的两种方式对CNTF进行改造。本研究中我们采用常规分析手段对PEG20k-CNTF和Tf-PEG5k-CNTF进行对比表征。高效凝胶过滤和动态光散射分析结果显示两者拥有相近的表观分子体积。细胞试验结果显示两种耦合物的活性分别下降至未修饰CNTF的50.6%和65.8%。抗体CNTF抗体亲和力结果显示PEG20k修饰后亲合力下降至原蛋白的3.8%，转铁蛋白偶联后保留89.9%原蛋白亲合力。药代动力学结果显示PEG20k-CNTF和Tf-PEG5k-CNTF在SD大鼠血液中的保留半衰期分别为5.34 ± 0.26和8.65 ± 0.60小时，与未修饰rhCNTF相比延长了约21.4倍和34.6倍。药效学结果显示在每周两次每次1.0 mg/kg （rhCNTF等量）的给药频率和剂量，PEG20k-CNTF比Tf-PEG5k-CNTF更显著地降低实验小鼠体重。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 琼脂糖微球是生化分离领域应用最广泛的分离介质基质，但尚存在微球粒径不均一、机械强度低以及原料的转化率低等问题，这导致生物大分子的分离纯化以及大规模层析生产效率低、工艺复杂化，成为了生化分离领域的发展瓶颈。常规搅拌等方法所制备的琼脂糖微球中琼脂糖含量大多小于6 wt%，当琼脂糖含量超过6 wt%时，水相粘度过大，传统的制备方法很难将高粘度的水相均匀地分散到油相中形成均一的乳液，导致生成的乳液粒径不均一。对于生化分离介质来说，小粒径介质能提供大比表面积，分辨率高；高琼脂糖含量不仅可以提高介质强度，还能丰富微球中的有效官能基团，为后续衍生应用提供基础。 本研究采用新型快速膜乳化技术，将琼脂糖加热溶解后，配制成所需浓度的琼脂糖溶液作为水相。将一定量的油溶性乳化剂溶于与水不相溶的有机相中并预热到一定温度下作油相。利用搅拌法将水相与油相混合制备得到W/O 型初乳液。利用快速膜乳化技术，通过调控压力，将初乳液迅速通过疏水修饰后SPG 膜得到粒径均一的W/O 型乳液，最后在缓慢搅拌的条件下冷却固化乳液胶凝，得到粒径均一的琼脂糖微球。 以6%琼脂糖浓度微球为例，在以石油醚及液体石蜡作为油相，与外水相体积比为1:6下，过膜压力0.3kgf/cm2的条件下，得到的微球平均粒径为30μm，Span值=0.62，CV 值=25%。对比市售Sepharose 6FF介质，粒径由90μm降到了30μm，而其CV 值提高了47%。而整个制球过程时间不超过10min，琼脂糖原料的成球转化率达到了100%。研究结果表明，当琼脂糖浓度分别达到8%、10%、12%、16%时，利用快速膜乳化法制备出的微球粒径可达28-32μm，Span值<0.9，CV 值<18%。 快速膜乳化制备的8%浓度琼脂糖微球经交联再通过烯丙基缩水甘油醚活化并偶联磺酸基制备成阳离子交换介质。上述介质用于纯化抗生素（万古霉素和螺旋霉素），粗品经柱上层析分离后，收集洗脱液，用HPLC分析纯品含量。研究结果表明，万古霉素纯度由88.7%提高至95.1%，螺旋霉素纯度提高至99.9%，纯度有了极大地提高。 快速膜乳化具有简单、高效等优点，在制备均一小粒径、高琼脂糖含量的分离介质方面具有突出优势。同时该方法也适用于其他载药纳微球的制备，有很好的应用前景。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 层析技术在生物分离纯化领域占有非常重要的地位。作为该技术主要组成部分，层析介质的结构与性能极大地影响最终分离纯化效果。其中，载量是决定介质分离纯化能力的重要性质，如何提高介质载量是生物分离工程领域一直关注的重点。本论文以高载量琼脂糖层析介质为目标，分别开展了琼脂糖疏水层析介质和金属螯合层析介质的tailor-made研究。对于琼脂糖疏水层析介质，引入不同长度间臂，实现疏水性质可控制备，并用于CHO细胞表达乙肝表面抗原纯化，该方法能显著提高介质对疫苗的结合量，疫苗活性回收率达90%以上，纯化倍数65.8，均优于传统疏水介质。对于琼脂糖金属螯合介质，通过采取接枝葡聚糖策略，同时调控接枝程度，实现葡聚糖接枝可控制备。这种接枝型金属螯合介质对组氨酸标记重组蛋白的载量较传统介质提升1.5倍以上，远优于传统介质。Tailor-made型高载量层析介质在重组蛋白大规模分离纯化领域前景广阔。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-08-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 优化并全合成里氏木霉几丁质酶基因，在毕赤酵母中实现分泌表达。产物几丁质酶的蛋白浓度达0.17 mg/mL，最适pH为5.6，最适温度为65 ℃，酶活为0.52 U/mL。该酶在50 ℃及以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并对产物的组成及结构进行分析。超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（Ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF MS）检测及分析结果显示，酶解产物中包含至少41种聚合度2-18，不同脱乙酰度的壳寡糖组分；核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）检测及分析结果显示，产物壳寡糖的还原端主要为N-乙酰氨基葡萄糖，非还原端则同时含有N-乙酰氨基葡萄糖及氨基葡萄糖。相关结果可为壳寡糖的结构与功能关系研究提供参考。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-06-14 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 对来源于枯草芽孢杆菌菌株168（Bacillus subtilis 168）的壳聚糖酶编码基因进行了序列优化及全合成并在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现了分泌表达，表达产物的蛋白浓度达到0.30 mg/ml。表达的壳聚糖酶最适pH为5.6，最适温度为55 ℃，比酶活达84.54 U/ml。该酶在50 ℃及以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（Ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF MS）对产物的组分进行了分离及鉴定。根据一级质谱信息，推测酶解产物中包含至少37种聚合度2-18，不同脱乙酰度的壳寡糖组分。综上，利用毕赤酵母分泌表达了来源于枯草芽孢杆菌菌株168的壳聚糖酶基因，利用表达产物水解制备了低脱乙酰度壳寡糖并对其组分进行了分析，可为后续壳寡糖结构与功能关系的研究提供参考。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 糖工程是研究糖类物质的结构、功能、制备技术及其应用的一门学科。近30年，随着糖链功能研究技术手段的不断进步，大量的糖链结构及其生物学功能被阐明，糖链与生长、发育、疾病过程的密切关系被逐步揭示，以此为基础的糖生物工程的基础与应用研究蓬勃发展，已成为继基因工程、蛋白质工程之后，最为引人注目的新生物技术领域。当前国内外糖工程研究方兴未艾，对该领域的综述论文并不鲜见，但多侧重于对基础理论研究的讨论。本文着重介绍糖工程技术及产业化发展的状况，重点论述近年来我国糖工程的主要产品、市场状况、国内外研发动向及糖工程科技创新情况，并讨论了我国糖工程发展面临的机遇与挑战，为从事糖工程教学、科研及应用开发的广大学者、科研工作者及产业技术人员提供参考。
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