分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid, α-KG）是谷氨酸脱氨基的酮酸产物，作为一种重要的有机酸广泛用于食品、医药、精细化工等领域。为提高L-氨基酸脱氨酶全细胞催化法合成α-KG的效率及产量，首先通过优化全细胞催化剂制备条件及全细胞转化反应条件，包括发酵过程中的温度、pH、诱导剂浓度，诱导剂添加时刻、诱导时间等；全细胞转化过程中的温度、pH、细胞量、转化时间。各个条件优化后以200 g·L-1谷氨酸钠为底物时，产量最终提高了54.9 %，摩尔转化率为39.6 %。其次，通过定点饱和突变对L-氨基酸脱氨酶进行定向进化以提高其催化能力。经过多次突变、筛选，最优突变体E.coli BL21-pET-20b(+)-pm1152催化200 g·L-1谷氨酸钠生成α-KG最高产量为 100.9 g·L-1，摩尔转化率为64.7 %，较最初对照菌株提高了66.3 %。结果表明，条件优化和饱和突变可有效提高重组大肠杆菌全细胞转化合成α-KG的能力。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 纤维二糖可有效诱导丝状真菌产纤维素酶，前期研究表明匍枝根霉Rhizopus stolonifer TP-02具有纤维二糖合成酶（CBS），可以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）为糖基供体合成纤维二糖，从而开启纤维素酶的自诱导合成途径。为研究R. stolonifer中纤维二糖的胞内合成途径，通过重叠PCR在GDP-葡糖焦磷酸化酶基因ggp中引入硫胺吡啶抗性基因ptrA，分别转化原菌TP-02和△ugp突变株，构建△ggp和△ugp/△ggp突变株。利用液质联用（LC-MS）检测突变株的胞内糖组分，发现ggp的缺失对胞内纤维二糖合成的影响较弱，而同时缺失ugp则将直接导致二糖合成受阻。RT-qPCR结果显示△ggp突变株中纤维素酶基因转录水平较原株TP-02下调20%左右，而△ugp/△ggp突变株中被测基因的转录水平则出现了高达80%左右的下调。同时对突变株纤维素酶表达水平进行研究，发现△ugp/△ggp突变株中几乎检测不到纤维素酶活力。结果显示，UDPG为R. stolonifer胞内合成纤维二糖的主要糖基供体，而GDPG可能是UDPG的替代物，在UDPG不足时维持胞内二糖合成。此外，利用生物信息学方法对CBS结构功能深入分析，经丙氨酸扫描确定其合成纤维二糖的关键作用残基为Asp210和Asp300，为后续进一步研究及理性改造提供方向和理论依据。
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