分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：针对目前检测领域缺乏诺如病毒（Norovirus, NoV）核酸标准样品这一瓶颈，本研究基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术构建内含GII型NoV检测靶标RNA的病毒样颗粒（Virus like particles, VLPs）标准参考样品。方法：人工合成包含Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、ISO/T15216-2 2012中规定的GII型NoV检测靶标对应的cDNA序列及辅助多克隆位点的DNA片段QINVGII，将其克隆到pET-28a(+)载体中，构建重组质粒pET-QINVGII。将pET-QINVGII转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和透射电镜分析后，利用氯化铯密度梯度离心，制备纯化VLPs，并对纯化后的VLPs开展均匀性、稳定性及定值研究。结果：SDS-PAGE结果证实重组大肠杆菌在14.1 kDa左右有目的条带表达；透射电镜下可观察到大量结构完整，直径约为25 nm的VLPs。定值结果显示，本研究制备的VLPs样品中GII型NoV检测靶标RNA的含量为（1.06±0.06)×107 copies/μl；均匀性分析结果表明样品均匀性良好，即F =2.24＜F0.05（9，20）；稳定性结果表明，本研究制备的VLPs在37℃可保存12天、室温（20-25℃）可保存24天、4℃至少可保存90天、-20℃至少可保存200天、-80℃至少可保存300天。结论：本研究基于Qbeta噬菌体制备的NoV装甲RNA均匀性和稳定性良好，拷贝数高，为NoV分子检测提供了良好的标准参考样品。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：针对目前检测领域缺乏诺如病毒（Norovirus, NoV）核酸标准样品这一瓶颈，本研究基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术构建内含GII型NoV检测靶标RNA的病毒样颗粒（Virus like particles, VLPs）标准参考样品。方法：人工合成包含Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、ISO/T15216-2 2012中规定的GII型NoV检测靶标对应的cDNA序列及辅助多克隆位点的DNA片段QINVGII，将其克隆到pET-28a(+)载体中，构建重组质粒pET-QINVGII。将pET-QINVGII转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和透射电镜分析后，利用氯化铯密度梯度离心，制备纯化VLPs，并对纯化后的VLPs开展均匀性、稳定性及定值研究。结果：SDS-PAGE结果证实重组大肠杆菌在14.1 kDa左右有目的条带表达；透射电镜下可观察到大量结构完整，直径约为25 nm的VLPs。定值结果显示，本研究制备的VLPs样品中GII型NoV检测靶标RNA的含量为（1.06±0.06)×107 copies/μl；均匀性分析结果表明样品均匀性良好，即F =2.24＜F0.05（9，20）；稳定性结果表明，本研究制备的VLPs在37℃可保存12天、室温（20-25℃）可保存24天、4℃至少可保存90天、-20℃至少可保存200天、-80℃至少可保存300天。结论：本研究基于Qbeta噬菌体制备的NoV装甲RNA均匀性和稳定性良好，拷贝数高，为NoV分子检测提供了良好的标准参考样品。
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