分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 维生素K2是一种人体必需维生素，具有促进凝血酶原产生和骨钙素合成等作用，在损伤细胞修复方面也有明显效果。微生物发酵法制备维生素K2具有环境影响小、生物活性高、生产成本低等优点，是维生素K2规模化制备的发展趋势。利用超声波和表面活性剂提高微生物发酵过程中菌体细胞通透性是一种常见的细胞代谢人工调控方法。低功率超声波的空化作用可以在细胞表面瞬间造成微伤，使细胞膜局部破裂从而改变细胞膜的通透性，有利于胞内物质释放或胞外物质进入细胞内。表面活性剂有助于提高营养物质溶解性，降低培养基表面张力，减小菌体表面和培养基的界面阻力，从而促进营养物质和菌体代谢产物的跨膜传输。 本文对实验室保藏的一株产维生素K2黄杆菌（Flavobacterium.sp）Fla-M进行低功率超声波辐照和表面活性剂处理，考察二者在提高细胞渗漏发酵方面的协同作用。首先在500 mL摇瓶中对Fla-M进行表面活性剂（聚氧乙烯油醚POE）添加时间和添加浓度优化，发现在发酵起始阶段添加1%POE效果最佳，发酵结束时生物量为13.4 g/L，胞外维生素K2产量为36.3 mg/L，相比于未添加POE的对照组（生物量7.32 g/L，胞外维生素K2 0.85 mg/L）分别提高了83.5%和41倍，扫描电镜观察发现在添加POE发酵的菌体表面聚集了大量表面活性剂胶团，由于POE与细胞膜磷脂分子结构相似，二者可能相溶形成混合胶束改变了细胞膜结构，进而改善细胞膜的通透性。其次在500 mL摇瓶中对Fla-M进行了超声方式、超声时机、超声功率以及作用时间研究，发现在菌体生长稳定期（发酵第5 d）、120 W 20 KHz条件下，插入式超声98 S（每次3 S，间隔4 S）效果最佳，发酵结束时生物量为11.1 g/L，胞外维生素K2达到50.1 mg/L, 相比于未超声对照组（生物量7.32 g/L，胞外维生素K2 0.85 mg/L），分别提高了51.6%和58倍。透射电镜观察发现超声波处理后尽管细胞膜完整但磷脂双分子层界限模糊，且细胞膜表面有孔状破损结构，可见疑似内容物外渗现象。在上述最优条件下，在500 mL摇瓶中综合运用POE和超声的处理方法，生物量和胞外维生素K2产量在发酵6 d后达到最大值，分别为生物量11.5 g/L，胞外维生素K2 59.7 mg/L，较单独运用POE或超声的方法发酵周期缩短3 d、胞外维生素K2产量分别提高64.4%和19.1%。运用排斥性染料碘化丙啶(PI)对发酵后细胞进行流式细胞仪检测，设001号为阴性对照，即未加荧光载体的未处理菌体的荧光信号；002号为处理的菌体加荧光载体的荧光信号；003号为未处理菌体加荧光载体的荧光信号；004号为阳性对照，即死细胞加荧光载体的荧光信号，阴性对照的001号菌体自发荧光区域以外的面积M1占总面积的比例预设为0，结果显示004号的M1占总面积的比例17.21%>002号M1占总面积的比例8.89%>003号M1占总面积的比例1.21%，说明死菌体的细胞膜通透性>渗漏培养菌体的细胞膜通透性>无渗漏培养菌体的细胞膜通透性，验证了经超声和表面活性剂处理后，菌体细胞膜通透性大幅提高。本研究对发酵法制备维生素K2的产业化开发具有一定的借鉴意义。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 维生素K2（VK2）是一系列具有异戊二烯侧链的甲萘醌类化合物，根据侧链长短不同，以MK-n表示。高活性VK2主要由微生物合成，具有防治骨质疏松症、出血症、肝硬化及帕金森症等疾病的生理功能。黄杆菌是其重要生产菌株，可合成包括MK4，MK5和MK6多种VK2同系物。 我们发现通过调控发酵温度，可以控制黄杆菌合成VK2的同系物类型和产量。在20~37℃范围内，25℃时Flavobacterium sp. M1-14生长最好，生物量达到8.8 g/L，但发酵产物完全是MK6，产量为13.9 mg/L，单位菌体产量1.6 mg/g。当发酵温度高于30℃，黄杆菌可同时合成MK4、MK5和MK6。37℃时，MK4和MK5产量最高，分别为1.6mg/L和1.7mg/L，VK2总量12.5 mg/L，但此时生物量仅5.5g/L，单位菌体产量为2.3mg/g。针对黄杆菌菌体生长和VK2同系物合成的最适温度差异，考虑采用变温发酵提高生物量和VK2产量。经多因素优化后，我们开发出先低温后高温的两段式变温策略，即25℃先发酵48小时，之后转为37℃继续发酵96小时，VK2产量达到20.9 mg/L（其中MK4为2.1 mg/L，MK5为2.3 mg/L、MK6为16.5mg/L），生物量为8.8g/L，单位菌体产量2.4mg/g。 继而，在30L发酵罐上，我们通过控制通气量和转速，考察了不同温度发酵对氧需求情况。发现在25℃和37℃时，黄杆菌发酵合成VK2的最佳kLa分别为360 h-1和60 h-1。针对变温发酵过程中菌体对氧需求的变化，我们开发了两阶段变kLa控制策略。优化后在变温发酵前期24小时kLa为360 h-1，之后120小时kLa 为60 h-1，VK2产量达到28.7 mg/L，（其中MK4为2.8mg/L，MK5为3.4 mg/L、MK6为22.5 mg/L），较起始提高了107%，生物量为15.5 g/L，单位菌体产量1.9 mg/g。 通过变温变kLa分阶段发酵调控策略，可以改变黄杆菌合成VK2的同系物类型，明显提高VK2产量，为实现VK2生物制备的工业化奠定了优化的基础。
分类： 物理学 >> 普通物理:统计和量子力学,量子信息等 提交时间： 2017-09-20
摘要： 维生素K2（VK2）是一类脂溶性甲萘醌类化合物，根据其侧链中异戊烯基单元个数的不同，可用Menaquinone-n (MK-n, n=1~14) 表示。研究表明，VK2具有促凝血、预防及治疗骨质疏松症、帕金森症及心血管疾病等生理功能。利用微生物发酵生产的VK2具有全反式侧链、生物相容性高等优势，作为食品和药品更易于被消费者接受。但是，其下游分离纯化过程中存在产物浓度低、成分复杂、纯化工艺繁琐、产品得率低等诸多问题，目前还鲜有高纯度VK2制备工艺的报道。 黄杆菌可以合成MK-5和MK-6等VK2同系物，本研究针对其发酵产物的特点，开发了一整套相应的分离纯化工艺。首先通过膜浓缩和离心的方法快速获得黄杆菌菌体，菌体经干燥后，采用甲醇进行固-液萃取，固-液比为4:1（ml/g），萃取时间为20分钟，连续萃取3次，获得的VK2甲醇萃取液的萃取得率可达99.1%以上。然后，通过大孔树脂吸附层析,以甲醇/二氯甲烷=1/1（V/V）为洗脱液，可获得纯度约为15%的VK2粗品；再经过分子筛层析，在高径比为255:15，二氯甲烷为流动相时，可获得纯度约为57%的VK2低纯度产品；之后，经过反相硅胶柱层析，分别以甲醇/二氯甲烷=9:1,6:1,3:1（V/V）依次进行梯度洗脱，即可分离并纯化各VK2的同系物，其HPLC纯度均达90%以上。最后采用冷却结晶的方法制得一系列淡黄色晶体。通过质谱、红外光谱及核磁共振氢谱检测，均符合相应的VK2光谱特征，确定其为MK-5和MK-6晶体。经HPLC检测，MK-5和MK-6晶体纯度分别达到98.0%和99.3%。经多次重复实验后，表明全套工艺稳定，产物回收率可以达到88%以上。各填料经过15次重复利用后，其对VK2的纯度及回收率无明显的影响。 本研究所建立的从黄杆菌发酵液中提取和纯化VK2的方法具有工艺简单、处理能力大、产品纯度及得率高等优点，其为实现VK2的生物制备及其产业化奠定了优化的基础。在整个的提取、纯化及结晶的过程中，只有两种有机溶剂被使用，这更有利于有机溶剂的回收利用和VK2的规模化生产。
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