分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 维生素K2（VK2）是一系列具有异戊二烯侧链的甲萘醌类化合物，根据侧链长短不同，以MK-n表示。高活性VK2主要由微生物合成，具有防治骨质疏松症、出血症、肝硬化及帕金森症等疾病的生理功能。黄杆菌是其重要生产菌株，可合成包括MK4，MK5和MK6多种VK2同系物。 我们发现通过调控发酵温度，可以控制黄杆菌合成VK2的同系物类型和产量。在20~37℃范围内，25℃时Flavobacterium sp. M1-14生长最好，生物量达到8.8 g/L，但发酵产物完全是MK6，产量为13.9 mg/L，单位菌体产量1.6 mg/g。当发酵温度高于30℃，黄杆菌可同时合成MK4、MK5和MK6。37℃时，MK4和MK5产量最高，分别为1.6mg/L和1.7mg/L，VK2总量12.5 mg/L，但此时生物量仅5.5g/L，单位菌体产量为2.3mg/g。针对黄杆菌菌体生长和VK2同系物合成的最适温度差异，考虑采用变温发酵提高生物量和VK2产量。经多因素优化后，我们开发出先低温后高温的两段式变温策略，即25℃先发酵48小时，之后转为37℃继续发酵96小时，VK2产量达到20.9 mg/L（其中MK4为2.1 mg/L，MK5为2.3 mg/L、MK6为16.5mg/L），生物量为8.8g/L，单位菌体产量2.4mg/g。 继而，在30L发酵罐上，我们通过控制通气量和转速，考察了不同温度发酵对氧需求情况。发现在25℃和37℃时，黄杆菌发酵合成VK2的最佳kLa分别为360 h-1和60 h-1。针对变温发酵过程中菌体对氧需求的变化，我们开发了两阶段变kLa控制策略。优化后在变温发酵前期24小时kLa为360 h-1，之后120小时kLa 为60 h-1，VK2产量达到28.7 mg/L，（其中MK4为2.8mg/L，MK5为3.4 mg/L、MK6为22.5 mg/L），较起始提高了107%，生物量为15.5 g/L，单位菌体产量1.9 mg/g。 通过变温变kLa分阶段发酵调控策略，可以改变黄杆菌合成VK2的同系物类型，明显提高VK2产量，为实现VK2生物制备的工业化奠定了优化的基础。
分类： 物理学 >> 普通物理:统计和量子力学,量子信息等 提交时间： 2017-09-20
摘要： 维生素K2（VK2）是一类脂溶性甲萘醌类化合物，根据其侧链中异戊烯基单元个数的不同，可用Menaquinone-n (MK-n, n=1~14) 表示。研究表明，VK2具有促凝血、预防及治疗骨质疏松症、帕金森症及心血管疾病等生理功能。利用微生物发酵生产的VK2具有全反式侧链、生物相容性高等优势，作为食品和药品更易于被消费者接受。但是，其下游分离纯化过程中存在产物浓度低、成分复杂、纯化工艺繁琐、产品得率低等诸多问题，目前还鲜有高纯度VK2制备工艺的报道。 黄杆菌可以合成MK-5和MK-6等VK2同系物，本研究针对其发酵产物的特点，开发了一整套相应的分离纯化工艺。首先通过膜浓缩和离心的方法快速获得黄杆菌菌体，菌体经干燥后，采用甲醇进行固-液萃取，固-液比为4:1（ml/g），萃取时间为20分钟，连续萃取3次，获得的VK2甲醇萃取液的萃取得率可达99.1%以上。然后，通过大孔树脂吸附层析,以甲醇/二氯甲烷=1/1（V/V）为洗脱液，可获得纯度约为15%的VK2粗品；再经过分子筛层析，在高径比为255:15，二氯甲烷为流动相时，可获得纯度约为57%的VK2低纯度产品；之后，经过反相硅胶柱层析，分别以甲醇/二氯甲烷=9:1,6:1,3:1（V/V）依次进行梯度洗脱，即可分离并纯化各VK2的同系物，其HPLC纯度均达90%以上。最后采用冷却结晶的方法制得一系列淡黄色晶体。通过质谱、红外光谱及核磁共振氢谱检测，均符合相应的VK2光谱特征，确定其为MK-5和MK-6晶体。经HPLC检测，MK-5和MK-6晶体纯度分别达到98.0%和99.3%。经多次重复实验后，表明全套工艺稳定，产物回收率可以达到88%以上。各填料经过15次重复利用后，其对VK2的纯度及回收率无明显的影响。 本研究所建立的从黄杆菌发酵液中提取和纯化VK2的方法具有工艺简单、处理能力大、产品纯度及得率高等优点，其为实现VK2的生物制备及其产业化奠定了优化的基础。在整个的提取、纯化及结晶的过程中，只有两种有机溶剂被使用，这更有利于有机溶剂的回收利用和VK2的规模化生产。
点击量
点击量
下载量
评论
