分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 对香豆酸（p-coumaric acid）作为苯丙素类物质、芪类物质以及黄酮类物质的重要前体化合物，在生物医药、化妆品以及食品工业中均有广泛的应用价值。以酿酒酵母作为底盘菌株，利用合成生物学原理构建一株高产对香豆酸的人工酵母细胞。通过对比不同拷贝数的酪氨酸解氨酶（Tyrosine ammonia lyase, TAL）合成的对香豆酸产量，发现随着基因拷贝数的增加对香豆酸的产量也相应提高，高拷贝数的TAL有利于对香豆酸的积累；同时对酪氨酸的负反馈调控基因进行氨基酸定点突变得到ARO4K229L和ARO7G141S，利用delta位点将突变后的基因整合至酵母基因组，并挑取24株构建成功的酵母细胞进行发酵验证，发现菌株最高产量与最低产量相差28.87 mg/L；为了进一步增加对香豆酸的代谢通量，本研究对生成芳香醇类物质的旁路基因ARO10和PDC5进行敲除，发现同时敲除两个基因的菌株对香豆酸的产量最高，是敲除前产量的2.05倍（从42.71 mg/L到87.56 mg/L）；此外，通过设计前体酪氨酸的梯度添加实验，发现当添加1 mM的酪氨酸时，对香豆酸产量达到峰值174.57±0.30 mg/L，相较于未添加时提高了将近一倍。本研究通过运用合成生物学原理在酿酒酵母中实现了对香豆酸的高产，为后续的芪类化合物和黄酮类化合物生物合成奠定了基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 8二甲基异戊烯基柚皮素（8DN）作为生产黄酮类类药物淫羊藿苷的重要前体，在医药合成领域具有重大应用潜力。由于其合成路径及相关基因的复杂性，目前主要通过饲喂8DN的直接前体(柚皮素，异黄腐酚等）的方式合成8DN，而在生物体内全合成8DN的的研究工作还未见报道。为了实现8DN在酿酒酵母体内的生物全合成，该研究通过组合筛选8DN前体物柚皮素合成所需的多种外源基因（TAL，4CL，CHS，CHI），获得30株柚皮素生产菌，发现不同来源的基因组合引起柚皮素产量的明显差异（0.37mg/L-22.33mg/L）。并且利用Delta位点将较优的基因组合整合至酵母基因组，实现了稳定的柚皮素高产菌株（SyBE_Sc02050031）构建。在此基础上进一步导入带有苦参来源的异戊烯基转移酶基因（N8DT）多拷贝质粒，实现8DN合成的完整反应过程，8DN的摇瓶发酵产量达到36.7μg/L。另外通过关键限速酶N8DT的序列优化策略，发现截断定位信号肽序列的N8DT明显提高了从柚皮素到8DN这一关键反应的催化效果，8DN的产量提高到52.6 μg/L（144.2%）。该研究首次在酿酒酵母中成功构建高产8DN的生物全合成路径，为在微生物体内合成其他黄酮类天然产物提供了参考，具有重要的指导意义。
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