分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-04-19 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： SpyCatcher和SpyTag可通过自发反应形成共价键，产生稳定的分子自组装体。酶分子自组装体因具有高效有序的催化特性在合成生物学和纳米技术领域具有重要的应用价值。为探索SpyTag/SpyCatcher在大肠杆菌胞内多酶复合体系形成有序自组装分子能力，将SpyCatcher和SpyTag分别与P450BM3m单加氧酶和葡萄糖脱氢酶GDH进行融合表达，以期产生具有辅酶再生循环系统、高效生物合成靛蓝分子的SpyTag/SpyCatcher双酶自组装复合体。首先，通过电泳及质谱对重组工程菌表达蛋白进行分析，证实SpyCatcher-P450BM3m与SpyTag-GDH在胞内成功形成了自组装多酶复合体；然后，系统分析了不同培养条件下组装体合成靛蓝的能力，结果发现，经0.5mmol/L IPTG诱导后，菌体在16 ℃继续培养18 h后，工程菌对吲哚（2 mmol/L）与葡萄糖（4 mmol/L）的全细胞催化能力最强，靛蓝产量最高达258 mg/L，是未组装多酶系统的1.9倍，比P450BM3m单酶表达系统高约2.4倍；反应70 min后达到反应平衡，转化率为52%。本研究成功实现了SpyTag/SpyCatcher介导的多酶体系在大肠杆菌细胞中的自组装和高效转化体系，为胞内多酶复合物组装体的设计提供了新思路。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：建立谷氨酸依赖型氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应的96孔板高通量筛选方法，并用于大肠杆菌氨基转移酶WecE突变库的筛选。方法：通过优化偶联指示酶-谷氨酸脱氢酶、信号分子NADH浓度及双酶偶联反应时间，建立了光学法测定氨基转移酶活性的氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应方法；通过定点饱和突变技术构建了大肠杆菌氨基转移酶WecE的突变库；采用96孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了高活性的转氨酶突变体，并对纯化的突变体进行催化活力分析。结果：建立了谷氨酸依赖型氨基转移酶目标反应与0.5 U/mL L-谷氨酸脱氢酶和0.4 mmol/L NADH信号指示反应相偶联的筛选方法；构建了氨基转移酶WecE Tyr 321饱和突变库，通过96孔板高通量筛选，获得了催化活性比野生型提高3.4倍的突变体Y321F。结论：本研究建立了高通量筛选方法，背景干扰小，准确性高，为谷氨酸依赖型氨基转移酶分子进化提供了可行性方案。
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