分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 毕赤酵母作为常用的蛋白表达系统，广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中成功地得到表达。在工业酶制剂领域，也有许多酶制剂包括植酸酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等利用毕赤酵母实现了产业化规模的生产[1]。 酵母细胞壁在保护细胞完整性方面起到非常重要的作用，能够维持细胞渗透压平衡，在形态发生过程中产生并维持细胞的形态，并且在环境压力中有保护细胞的作用[2]。细胞壁主要由多糖和蛋白组成，其中多糖为β-1,3-葡聚糖，β-1,6-葡聚糖和几丁质，蛋白主要由N-和O-修饰的蛋白组成，在电子显微镜下观察发现，酵母的细胞壁厚约 200nm，分为电子密度不同的两层结构，外层甘露糖蛋白层和内层葡聚糖骨架[3]。GPI修饰的蛋白是一种通过糖脂共价连接在蛋白C端，从而将蛋白定位在细胞表面的一类蛋白。GPI修饰的蛋白在所有的真核细胞中都存在，并且其基本结构在大部分生物中都是保守的。通过对毕赤酵母全基因组中所有编码的蛋白序列进行分析，结合GPI型细胞壁蛋白的结构特征，最终在毕赤酵母GS115中发现50个潜在的GPI型细胞壁蛋白[4]，对这些蛋白的生化分析及功能鉴定需要进一步的探索。 通过对毕赤酵母GS115潜在的50个GPI细胞壁蛋白逐一进行单基因敲除，构建了GPI型细胞壁蛋白缺陷菌株库，研究了各细胞壁缺陷菌株在不同浓度碳源条件下的生长情况及细胞形态变化，以及细胞表面亲疏水变化及对细胞壁干扰剂的耐受性情况。研究发现敲除细胞壁蛋白会引起细胞多方面的变化，如对不同碳源的利用差异，对不同细胞壁干扰剂的耐受差异等。挑取一株甲醇耐受的菌株进行转录组学的分析，发现敲除后细胞代谢路径发生了明显变化，如细胞壁各组分的合成路径，细胞膜甾醇合成路径相关基因明显上调，同时一些胁迫路径也被激活，以抵抗高浓度甲醇对细胞的损害。通过对细胞壁蛋白功能进行深入的研究，将为毕赤酵母作为宿主菌表达外源蛋白提供重要的参考价值。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是近年来发展迅速的一种高效表达的宿主菌。毕赤酵母属甲醇营养型酵母，具有操作简便、易于高密度培养、生长迅速、对翻译后的蛋白进行加工、生产成本低等优点。毕赤酵母表达系统已有20多年的研究开发使用历史，有多种表达载体和改良的宿主菌可供选择，可进行胞内表达或分泌表达。利用基于同源重组的DNA转化系统将基因整合进基因组是目前最重要的基因编辑手段之一，已经被广泛应用于毕赤酵母中；但毕赤酵母面临着筛选标记不足的难题。 在Cre/loxP系统中，当两个loxP位点以顺时针相同的方向放在一段序列之间时，Cre酶能识别并切除该序列，留下一个loxP位点。当使用突变的loxP序列（例如lox71和lox66），当被Cre重组酶识别并进行作用后，会留下一个新的突变的lox72位点，并不会与下次引入的loxP位点进行作用，从而避免了残留的loxP位点与新引入的loxP位点被Cre重组酶识别的可能。 本文通过在毕赤酵母通用质粒pPICZA和pGAPZA的基础上，在博来霉素抗性基因表达盒后融合了诱导表达Cre的表达盒，并在这两个表达盒前后引入了lox71和lox66位点，分别构建了质粒pZACH和pGACH；进而进行筛选标记循坏利用。具体过程如下：1、质粒转化毕赤酵母，使用博来霉素进行抗性筛选得到阳性转化子；2、将阳性转化子接种于含有诱导剂甲醇的YPM培养基中，培养过夜；3、将培养过夜的含菌体的培养基划线于不含抗生素的YPD平板上，培养至酵母单菌落可见；4、将3中的酵母单菌落同时点种于不含抗生素的YPD平板和含博来霉素的YPDZ平板上，如能在YPD平板上生长而不能在YPDZ平板上生长，则说明该菌落的博来霉素抗性表达盒已丢失，再使用PCR鉴定进行验证。整个抗性素标记丢失需要约4-5天。 使用质粒pZACH分别在毕赤酵母中表达了来源于柠檬酸杆菌（Citrobacteramalonaticus）CGMCC 1696的植酸酶和来源于抗辐射不动杆菌（Acinetobacterradioresistens） CMC-1的脂肪酶，这些质粒的抗性素标记丢失效率均大于70%，而且植酸酶和脂肪酶的产量与菌体生长都和使用基础质粒pPICZA进行表达的结果相似。该质粒对外源蛋白表达以及菌体生长并无不良影响。 使用筛选标记循坏利用质粒pZACH和pGACH，可以克服毕赤酵母中筛选标记不足的缺点，便于更好地在毕赤酵母中进行基因改造，从而为毕赤酵母的进一步工业应用提供基础。
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