分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 低温CPC乙酰化酶在7-ACA的生物合成中具有重要作用和显著的优势，开发低温CPC乙酰化酶具有重大的经济价值。为了获得在低温下具有更高催化活性的CPC乙酰化酶，本文在前期的研究基础上，以先前获得的CA IIIM为亲本，借助分子对接的手段确定了它的底物结合区域，并利用pyMOL软件找出了底物结合区域Loop上关键的脯氨酸残基，分析后将选定的脯氨酸用甘氨酸进行替换。借助pET32a质粒在E. coli BL21(DE3)中进行了可溶性表达研究，除P272G外，其它突变体均实现了可溶性表达。P238G、P582G和P679G在13℃对CPC的催化活性分别为1.25、1.04和1.38 U/mg，较亲本的0.85 U/mg有了显著的提高。此外，分别考察了亲本及突变体的温度稳定性，它们之间无明显的差异。然后，在13℃下进行了7-ACA低温生物合成的研究，结果表明反应24 h后CPC的转化率也能达到80%以上。本研究在CPC乙酰化酶冷适应性改造方面取得了较为理想的结果，为进一步的改造及应用奠定了坚实的基础，也为其它低温酶的创制提供了可资借鉴的经验。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 低温CPC乙酰化酶在7-ACA的生物合成中具有重要作用和显著的优势，开发低温CPC乙酰化酶具有重大的经济价值。为了获得在低温下具有更高催化活性的CPC乙酰化酶，本文在前期的研究基础上，以先前获得的CA IIIM为亲本，借助分子对接的手段确定了它的底物结合区域，并利用pyMOL软件找出了底物结合区域Loop上关键的脯氨酸残基，分析后将选定的脯氨酸用甘氨酸进行替换。借助pET32a质粒在E. coli BL21(DE3)中进行了可溶性表达研究，除P272G外，其它突变体均实现了可溶性表达。P238G、P582G和P679G在13℃对CPC的催化活性分别为1.25、1.04和1.38 U/mg，较亲本的0.85 U/mg有了显著的提高。此外，分别考察了亲本及突变体的温度稳定性，它们之间无明显的差异。然后，在13℃下进行了7-ACA低温生物合成的研究，结果表明反应24 h后CPC的转化率也能达到80%以上。本研究在CPC乙酰化酶冷适应性改造方面取得了较为理想的结果，为进一步的改造及应用奠定了坚实的基础，也为其它低温酶的创制提供了可资借鉴的经验。
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