分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-21 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的 探讨肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中RIP140的表达对肝癌细胞侵袭、增殖的影响。方法 慢病毒介导小鼠腹腔巨噬细胞（PMs）RIP140的过表达，Western blot和Real-time PCR（qRT-PCR）分别检测PMs中RIP140蛋白以及核酸表达水平，流式细胞仪分析慢病毒转染率；Western blot、细胞免疫荧光和qRT-PCR检测肝癌条件培养基（HCM）刺激PMs后TAMs中RIP140的表达变化；HCM刺激PMs以及HCM刺激过表达RIP140的PMs，qRT-PCR检测TAMs极化指标以及NF-κB和IL-6的表达；Transwell实验和细胞流式凋亡实验检测肝癌细胞的侵袭和凋亡；肝癌细胞和PMs以4∶1比例注射于BALB/c裸鼠皮下，建立裸鼠皮下肝癌模型，成瘤癌组织HE染色和免疫组化评定肝癌组织大体生长情况和肝癌细胞增殖能力。结果 慢病毒介导PMs RIP140的过表达，病毒转染效率高，RIP140过表达明显；HCM刺激PMs后，TAMs中RIP140呈低表达；HCM诱导TAMs呈M2型极化，并且与肿瘤生长密切相关的NF-κB-IL-6轴处于活化状态；TAMs可促进肝癌细胞侵袭和增殖，抑制肝癌细胞凋亡。TAMs过表达RIP140可抑制HCM介导的TAMs M2型极化并抑制NF-κB/IL-6通路的激活，减少IL-6的释放；除此之外，TAMs过表达RIP140可抑制肝癌细胞的侵袭和增殖，促进肝癌细胞的凋亡。结论 过表达RIP140的TAMs可抑制肝癌细胞的侵袭和增殖。其机制可能与TAMs过表达RIP140后抑制TAMs M2型极化有关。
分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-07 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的 对比不同的转染试剂转染RIP140-siRNA至肝脏库普弗细胞的转染效率及它们对肝脏库普弗细胞的细胞毒性，从而寻找出最佳的肝脏库普弗细胞试剂转染方法和条件。 方法 以肝脏库普弗细胞为研究对象，以绿色荧光蛋白（GFP）标记的RIP140-siRNA为报告基因（reporter gene），采用lipofectamine 2000，罗氏试剂（X-treme GENE siRNA Transfection Reagent）及嘌呤霉素筛选的慢病毒（1.0×10 8 TU/mL）作为转染试剂，荧光倒置显微镜下观察细胞转染效果，激光扫描共聚焦显微镜分析不同试剂转染后细胞RIP140的表达，流式细胞术检测各组细胞凋亡，CCK-8检测各组细胞增殖抑制情况。收集细胞并进行裂解，提取细胞RNA与蛋白质，运用RT-RCR和Western blot实验法检测转染RIP140-siRNA后的基因及蛋白质表达情况。结果 对于肝脏库普弗细胞而言，在转染效率方面：嘌呤霉素筛选的慢病毒转染效率最高，可达90%以上；罗氏试剂其次；lipofectamine2000效果最差。在试剂的细胞毒性方面：流式细胞术及CCK-8检测结果显示罗氏试剂的细胞毒性最小，细胞可见其原有形态；慢病毒其次；lipofectamine 2000细胞毒性最大，可见多数细胞失去原有形态，并存在细胞裂解状态。RT-RCR和Western blot实验显示慢病毒转染RIP140-siRNA的肝脏库普氏细胞组无论在基因方面还是在蛋白质水平均明显低表达于lipofectamine 2000和罗氏试剂所转染的肝脏库普弗细胞组（P<0.05）。 结论 对于原代细胞肝脏库普弗细胞，在试剂转染方面，慢病毒转染方法可以达到理想的转染效率和较小的细胞毒性，且条件可控性与稳定性方面更加优越。
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