分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种重要的半纤维素酶，也是两种重要的饲用酶制剂，本研究利用毕赤酵母表达系统中的体外串联表达盒构建多拷贝的方法构建了木聚糖酶DSB和甘露聚糖酶ManA共表达重组质粒pPICZαA/DSB-ManA，将该重组质粒电转化至宿主菌毕赤酵母X33中获得共表达两种酶的重组菌X33/ DSB-ManA，实现了两种酶的共分泌表达，经诱导表达后木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活分别为273.6 U/mL和256.8 U/mL，为单独表达重组菌X33/DSB和X33/ManA酶活的30.4%和73.4%。酶学性质的分析显示DSB和ManA的最适反应温度均为75℃，在45℃-75℃范围内具有较好的温度稳定性，酶活可保持最高酶活的60%以上；DSB最适pH为6.5，ManA最适pH为6.0，在pH 3.0、40℃条件下，ManA处理1 h能保持最高酶活的80%以上，DSB处理1 h时能保持最高酶活的50%以上；DSB和ManA对多种金属离子和化学试剂（浓度为1 mM）具有较好的耐受性，均可保留60%以上的酶活力。本研究利用单一菌株成功完成了不同酶的共表达，为复合酶饲料添加剂的生产和应用研究提供了一定的理论依据。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种主要的半纤维素酶，广泛应用于诸多领域。本研究选择了3种毕赤酵母内源信号肽Scw11、Dse4和Exg1，以α-factor为参照，分别在毕赤酵母X33中用于表达实验室前期获得的耐热木聚糖酶DSB和耐热甘露聚糖酶ManA，选择适合DSB和ManA表达的信号肽以提高胞外酶活水平。结果表明不同信号肽引导的两种半纤维素酶的酶活水平相差较大：对DSB（分子量为23 KDa），α-factor介导的表达效率明显优于其它3种信号肽；但对ManA（分子量为30 KDa），Dse4和α-factor介导的表达效率相当且明显优于Scw11和Exg1。因此在X33中表达DSB时应选用α-factor，而表达ManA时应选用Dse4或α-factor。此外胞内酶活的结果显示α-factor介导的DSB和ManA重组菌胞内滞留酶活明显高于其它信号肽，而分子量为30 KDa的ManA的滞留酶活又明显高于分子量为23 KDa的DSB，因此在表达ManA蛋白时，选用其它的信号肽，如Dse4，会减少外源蛋白在胞内的滞留从而在一定程度上提高外源蛋白的分泌量。本研究为毕赤酵母表达系统鉴定更多可用的信号肽并筛选到针对目的蛋白的最优信号肽奠定了一定的基础。
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