分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-02-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 摘要：以毕赤酵母为异源表达宿主合成人胰岛素前体，在实验室研究和工业生产中已有广泛应用。目前研究主要使用天然甲醇诱导型AOX1启动子，以甲醇为单一基础碳源进行胰岛素前体的诱导发酵生产。但在毕赤酵母高密度发酵生产过程中，甲醇代谢过程耗氧大、产热高，补料控制工艺复杂，限制了发酵生产的放大。本研究基于我们前期对启动子AOX1的转录调控设计研究，提出以人工设计的高效组成型转录调控器件CSAD_5驱动胰岛素前体基因表达，开发了葡萄糖为碳源的发酵生产工艺，以解决甲醇体系中的产热、耗氧以及工艺控制问题。在此基础上，通过增强筛选压力提高异源基因拷贝，获得了一株胰岛素前体高表达重组毕赤酵母，利用优化的培养工艺在5 L反应器水平发酵生产，胰岛素前体产量在108 h达到1.85 g/L，为目前报道以葡萄糖为碳源，生产人胰岛素前体的最高水平。该研究为胰岛素前体的工业生产以及毕赤酵母的应用提供了新的思路和方法。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：利用昆虫细胞表达系统生产重组的人增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen, PCNA），并进行纯化和抗体结合特性鉴定。方法：以HeLa细胞逆转录的cDNA为模板，扩增人PCNA基因，并插入杆状病毒载体AcMNPV。利用昆虫细胞得到PCNA基因的重组杆状病毒。病毒感染细胞表达蛋白，联合镍柱亲和层析和离子交换层析获得高纯度的重组人PCNA蛋白。ELISA法测定抗体结合特异性。结果：以HeLa细胞cDNA为模板得到的基因序列同GenBank的人PCNA基因序列一致。草地贪夜蛾细胞（Spodoptera frugiperda, Sf9）表达重组人PCNA（Recombinant human PCNA, rPCNA）的最佳感染值（MOI）和感染时间分别为0.05和144 h。rPCNA的产量高达110 mg/L细胞，纯度> 95％。间接ELISA法检测抗体结合特性，rPCNA的敏感性和特异性分别为93.3％和85.0％。结论：建立了rPCNA的表达和纯化方法，获得了高效表达、高度抗体结合特异性的PCNA蛋白，该蛋白能进一步开发为PCNA相关疾病的体外诊断试剂盒，具较大的应用价值。
点击量
点击量
下载量
评论
