分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 熊胆粉作为保健食品和药品已经被使用了近千年。熊脱氧胆酸(Ursodeoxycholic acid, UDCA)是熊胆粉(需求量约为45吨/年)的主要活性成分，广泛用于脂肪性肝病、药物性肝炎、病毒性肝炎等胆汁淤积性肝病。7β-羟基甾醇脱氢酶(7β-HSDH, hydroxysteroid dehydrogenase)是双酶偶联法(图1)催化鹅脱氧胆酸(Chenodeoxycholic acid, CDCA)转化合成熊脱氧胆酸的关键瓶颈酶，其活性、稳定性以及辅酶亲和力均显著影响酶促生物转化路线的技术经济性。我们通过基因挖掘手段获得一个新酶7β-HSDHRt。然而, 迄今报道的所有7β-羟基甾醇脱氢酶大多具有活性低、稳定性差以及工作pH与7-HSDH不相容等共同缺陷, 从而导致目标产物UDCA的时空产率十分有限[1]。因此，采用酶工程技术大幅度提高相关酶的催化性能是决定生物技术能否拯救黑熊的关键所在。在此报告中我们提出了一种多目标共进化策略(MODE, multiobjective directed evolution)，用于改造7β-羟基甾醇脱氢酶的催化活性、热稳定性和最适pH值[2]。通过易错PCR、DNA shuffling和定点突变等方法，最终所得突变体V3−1的比活力比野生酶高 5.5倍，而半衰期延长3倍。此外，突变体的最适pH向弱碱性移动(pH 6.5pH 7.5)，从而更接近于前置酶7-HSDH所催化脱氢反应的酸碱度(pH 8.0)。使用上述共进化的突变酶V3−1进行级联转化反应时，UDCA 的时空产率达到 942 g L−1 d−1, 显著高于天然酶的 141 g L−1 d−1。由此可见，酶催化剂的蛋白质工程改造技术在提高酶的催化合成潜能，促进生物催化工艺在绿色化工制药领域的应用，以及在服务生态文明建设、推动环境保护和生态平衡等方面，均将发挥强大的威力。
分类： 物理学 >> 普通物理:统计和量子力学,量子信息等 提交时间： 2017-09-20
摘要： 光学纯脂肪族羟基酸及其衍生物是重要的手性砌块，可以用于制备多种天然产物或生物活性分子。例如，长链γ-, δ-羟基酸通过分子内环化得到的手性内酯，是一种重要的香料分子，在食品和精细化工领域有重要的应用价值。研究表明酮酸或酮酯的不对称还原反应是合成手性羟基酸/羟基酯最高效和最具原子经济性的路径。然而，迄今为止绝大多数研究报道的酶或化学催化剂作用的底物范围局限于α-, β-芳香族酮酯或短链酮酯，除酿酒酵母、毕赤酵母等细胞催化以外，针对长链脂肪族γ-, δ-酮酸/酮酯的酶催化高立体选择性不对称还原反应仍然是一个重大挑战。因此，挖掘和改造对长链脂肪族γ-, δ-酮酸/酮酯具有高活力和高选择性的新酶具有重要的科学和应用价值。 本文本论文首先采用传统方法从土壤中筛选到能够不对称还原4-羰基癸酸的新型催化剂Pseudomonas panipatensis。接着将该野生菌进行全基因组测序，以基因狩猎的方法从该菌中成功克隆出目标酶PpCR（Pseudomonas panipatensis carbonyl reductase），该羰基还原酶的辅酶依赖型为NADPH。然后以PpCR为探针，通过数据库挖掘，筛选到催化性能更优良的羰基还原酶SmCR（Serratiamarcescens carbonyl reductase）。对SmCR的催化性质进行研究，发现其最适反应pH为6.0，最适反应温度为40oC。SmCR在30oC下相对稳定，半衰期为90 h。在40oC和50oC下的半衰期为50 h 和15 h。对于4-羰基癸酸，SmCR的Km值为1.26 mM，kcat为0.128 min-1。 在100 mL 100 mM的pH 6.0磷酸钠缓冲液中进行手性内酯的制备反应，4-羰基癸酸的浓度为2 mM，获得产物(R)-γ-癸内酯的ee值为99%，分离得率为72%。以5-羰基癸酸为底物在相同条件下进行制备，获得ee值为95%的(R)-γ-癸内酯，分离得率为70%。论文结果证明SmCR是首个不对称还原4-羰基癸酸和5-羰基癸酸的还原酶，在(R)-γ-癸内酯和(R)-γ-癸内酯的生产具有潜在的应用价值。
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