分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-12-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 人类线粒体N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（mitochondrial O-GlcNAc transferse, mOGT）通过其N端基质导向序列(matrix targeting sequence，MTS）定位于线粒体内膜上，mOGT的过表达将导致细胞的凋亡。蛋白质的O-GlcNAc修饰存在于绝大多数真核生物中，而酿酒酵母唯独缺乏该修饰途径。对人体mOGT过表达引起酿酒酵母生长缺陷的机理进行分析，期望利用该模型研究mOGT导致的细胞凋亡调控机制。在酿酒酵母细胞中表达人体mOGT及其截短序列发现：mOGT对酿酒酵母的生长抑制及细胞中的定位依赖于N端全长的MTS序列；MTS序列在酿酒酵母中共表达导致线粒体融合。MTS序列过表达的酿酒酵母菌可以作为研究mOGT引起细胞凋亡的模式细胞。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-03-22 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 糖基转移酶Alg11作为N-糖基化途径中一个重要蛋白，功能为催化将甘露糖转移到底物DPGn2M3（Dolichyl-pyrophosphate-GlcNAc2Mannose3）上进而生成DPGn2M4和DPGn2M5这两种多萜醇寡糖前体的反应。在本研究中，首先通过对酿酒酵母Alg11的蛋白质结构进行分析，设计了去除跨膜域的蛋白Alg1145−548并成功在大肠杆菌中表达，进而对诱导时间、诱导剂浓度进行了产量最大化的优化，最终得到了纯化蛋白。以PPGn2（Phytanyl-pyrophosphate-GlcNAc2）为底物，利用体外表达的重组蛋白Alg1ΔTM和Trx-Alg2以酶法合成出Alg11的天然底物类似物PPGn2M3。用纯化的Alg1145−548蛋白催化转糖基反应，并通过液质联用（LC-MS）的方法检测产物，证实Alg1145−548蛋白具有催化PPGn2M3生成PPGn2M4和PPGn2M5的糖基转移酶活性。产物PPGn2M5通过不同的甘露糖苷酶酶切反应，验证了两个新加上的甘露糖以α-1,2糖苷键的形式连接到底物PPGn2M3上。底物特异性实验表明Alg1145−548可以特异性识别底物PPGn2M3，而其他N-糖基化中间体类似物如PPGn2和PPGn2M1无法被识别，且底物中的脂肪链结构也对酶的识别具有重要作用。Alg11的底物特异性保证了多萜醇寡糖前体的有序合成，具有重要的生理意义。
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