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1. chinaXiv:201709.00104 [pdf]

快速膜乳化技术制备均一小粒径、高浓度琼脂糖生化分离介质及用于抗生素高效分离纯化

朱凯; 赵岚; 黄永东; 马光辉
分类: 生物学 >> 生物工程

琼脂糖微球是生化分离领域应用最广泛的分离介质基质,但尚存在微球粒径不均一、机械强度低以及原料的转化率低等问题,这导致生物大分子的分离纯化以及大规模层析生产效率低、工艺复杂化,成为了生化分离领域的发展瓶颈。常规搅拌等方法所制备的琼脂糖微球中琼脂糖含量大多小于6 wt%,当琼脂糖含量超过6 wt%时,水相粘度过大,传统的制备方法很难将高粘度的水相均匀地分散到油相中形成均一的乳液,导致生成的乳液粒径不均一。对于生化分离介质来说,小粒径介质能提供大比表面积,分辨率高;高琼脂糖含量不仅可以提高介质强度,还能丰富微球中的有效官能基团,为后续衍生应用提供基础。 本研究采用新型快速膜乳化技术,将琼脂糖加热溶解后,配制成所需浓度的琼脂糖溶液作为水相。将一定量的油溶性乳化剂溶于与水不相溶的有机相中并预热到一定温度下作油相。利用搅拌法将水相与油相混合制备得到W/O 型初乳液。利用快速膜乳化技术,通过调控压力,将初乳液迅速通过疏水修饰后SPG 膜得到粒径均一的W/O 型乳液,最后在缓慢搅拌的条件下冷却固化乳液胶凝,得到粒径均一的琼脂糖微球。 以6%琼脂糖浓度微球为例,在以石油醚及液体石蜡作为油相,与外水相体积比为1:6下,过膜压力0.3kgf/cm2的条件下,得到的微球平均粒径为30μm,Span值=0.62,CV 值=25%。对比市售Sepharose 6FF介质,粒径由90μm降到了30μm,而其CV 值提高了47%。而整个制球过程时间不超过10min,琼脂糖原料的成球转化率达到了100%。研究结果表明,当琼脂糖浓度分别达到8%、10%、12%、16%时,利用快速膜乳化法制备出的微球粒径可达28-32μm,Span值<0.9,CV 值<18%。 快速膜乳化制备的8%浓度琼脂糖微球经交联再通过烯丙基缩水甘油醚活化并偶联磺酸基制备成阳离子交换介质。上述介质用于纯化抗生素(万古霉素和螺旋霉素),粗品经柱上层析分离后,收集洗脱液,用HPLC分析纯品含量。研究结果表明,万古霉素纯度由88.7%提高至95.1%,螺旋霉素纯度提高至99.9%,纯度有了极大地提高。 快速膜乳化具有简单、高效等优点,在制备均一小粒径、高琼脂糖含量的分离介质方面具有突出优势。同时该方法也适用于其他载药纳微球的制备,有很好的应用前景。

提交时间: 2017-09-20 来自合作期刊:《中国生物工程学会》 点击量270, 下载量61

2. chinaXiv:201709.00103 [pdf]

高载量层析介质的tailor-made策略及在复杂生物大分子分离纯化领域的应用研究

赵岚; 黄永东; 朱凯; 吴学星; 李强; 苏志国; 马光辉
分类: 生物学 >> 生物工程

层析技术在生物分离纯化领域占有非常重要的地位。作为该技术主要组成部分,层析介质的结构与性能极大地影响最终分离纯化效果。其中,载量是决定介质分离纯化能力的重要性质,如何提高介质载量是生物分离工程领域一直关注的重点。本论文以高载量琼脂糖层析介质为目标,分别开展了琼脂糖疏水层析介质和金属螯合层析介质的tailor-made研究。对于琼脂糖疏水层析介质,引入不同长度间臂,实现疏水性质可控制备,并用于CHO细胞表达乙肝表面抗原纯化,该方法能显著提高介质对疫苗的结合量,疫苗活性回收率达90%以上,纯化倍数65.8,均优于传统疏水介质。对于琼脂糖金属螯合介质,通过采取接枝葡聚糖策略,同时调控接枝程度,实现葡聚糖接枝可控制备。这种接枝型金属螯合介质对组氨酸标记重组蛋白的载量较传统介质提升1.5倍以上,远优于传统介质。Tailor-made型高载量层析介质在重组蛋白大规模分离纯化领域前景广阔。

提交时间: 2017-09-20 来自合作期刊:《中国生物工程学会》 点击量211, 下载量16

3. chinaXiv:201709.00102 [pdf]

超声与表面活性剂对维生素K2渗漏发酵的协同作用研究

赵根海; 杨强; 方雪; 刘会; 孙小雯; 倪文枫; 郑之明
分类: 生物学 >> 生物工程

维生素K2是一种人体必需维生素,具有促进凝血酶原产生和骨钙素合成等作用,在损伤细胞修复方面也有明显效果。微生物发酵法制备维生素K2具有环境影响小、生物活性高、生产成本低等优点,是维生素K2规模化制备的发展趋势。利用超声波和表面活性剂提高微生物发酵过程中菌体细胞通透性是一种常见的细胞代谢人工调控方法。低功率超声波的空化作用可以在细胞表面瞬间造成微伤,使细胞膜局部破裂从而改变细胞膜的通透性,有利于胞内物质释放或胞外物质进入细胞内。表面活性剂有助于提高营养物质溶解性,降低培养基表面张力,减小菌体表面和培养基的界面阻力,从而促进营养物质和菌体代谢产物的跨膜传输。 本文对实验室保藏的一株产维生素K2黄杆菌(Flavobacterium.sp)Fla-M进行低功率超声波辐照和表面活性剂处理,考察二者在提高细胞渗漏发酵方面的协同作用。首先在500 mL摇瓶中对Fla-M进行表面活性剂(聚氧乙烯油醚POE)添加时间和添加浓度优化,发现在发酵起始阶段添加1%POE效果最佳,发酵结束时生物量为13.4 g/L,胞外维生素K2产量为36.3 mg/L,相比于未添加POE的对照组(生物量7.32 g/L,胞外维生素K2 0.85 mg/L)分别提高了83.5%和41倍,扫描电镜观察发现在添加POE发酵的菌体表面聚集了大量表面活性剂胶团,由于POE与细胞膜磷脂分子结构相似,二者可能相溶形成混合胶束改变了细胞膜结构,进而改善细胞膜的通透性。其次在500 mL摇瓶中对Fla-M进行了超声方式、超声时机、超声功率以及作用时间研究,发现在菌体生长稳定期(发酵第5 d)、120 W 20 KHz条件下,插入式超声98 S(每次3 S,间隔4 S)效果最佳,发酵结束时生物量为11.1 g/L,胞外维生素K2达到50.1 mg/L, 相比于未超声对照组(生物量7.32 g/L,胞外维生素K2 0.85 mg/L),分别提高了51.6%和58倍。透射电镜观察发现超声波处理后尽管细胞膜完整但磷脂双分子层界限模糊,且细胞膜表面有孔状破损结构,可见疑似内容物外渗现象。在上述最优条件下,在500 mL摇瓶中综合运用POE和超声的处理方法,生物量和胞外维生素K2产量在发酵6 d后达到最大值,分别为生物量11.5 g/L,胞外维生素K2 59.7 mg/L,较单独运用POE或超声的方法发酵周期缩短3 d、胞外维生素K2产量分别提高64.4%和19.1%。运用排斥性染料碘化丙啶(PI)对发酵后细胞进行流式细胞仪检测,设001号为阴性对照,即未加荧光载体的未处理菌体的荧光信号;002号为处理的菌体加荧光载体的荧光信号;003号为未处理菌体加荧光载体的荧光信号;004号为阳性对照,即死细胞加荧光载体的荧光信号,阴性对照的001号菌体自发荧光区域以外的面积M1占总面积的比例预设为0,结果显示004号的M1占总面积的比例17.21%>002号M1占总面积的比例8.89%>003号M1占总面积的比例1.21%,说明死菌体的细胞膜通透性>渗漏培养菌体的细胞膜通透性>无渗漏培养菌体的细胞膜通透性,验证了经超声和表面活性剂处理后,菌体细胞膜通透性大幅提高。本研究对发酵法制备维生素K2的产业化开发具有一定的借鉴意义。

提交时间: 2017-09-20 来自合作期刊:《中国生物工程学会》 点击量221, 下载量28

4. chinaXiv:201709.00101 [pdf]

枯草芽孢杆菌高效制备Tp-GUS的系统构建与应用

张正晖; 刘护; 李春
分类: 生物学 >> 生物工程

甘草酸(Glycyrrhizin,GL)是甘草最主要的有效成分之一,具有抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、抗炎、及促进肾上腺皮激素等功能,在食品添加剂和化妆品领域也有广泛的应用,是一种重要的精细化工产品1,2。其分子中含有两个葡萄糖醛酸基使得其极性较强,导致其难以有效透过细胞膜并进一步在细胞内发挥药理作用,故甘草酸并非是其发挥最佳药理作用的最佳分子形态3,4。甘草酸的衍生物如单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide,GAMG)和甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)分别为甘草酸经水解外侧的一个、两个葡萄糖醛酸基团的β-1,2糖苷键得到的产物。其中GAMG比GA缺少一个葡萄糖醛酸基团,极性中等,使得其在体内的溶解能力以及跨膜转运的能力得到很大提高,因此GAMG比GL和GA具有更高效的吸收率和利用度5。 课题组前期筛选出一种新型、特异性转化甘草酸生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸的嗜松篮状菌(Talaromycespinophilum)的β-葡萄糖醛酸苷酶(TpGUS)。基于TpGUS广泛的商用和医用价值,以及课题组前期的一系列研究工作,本课题将以有优异分泌性能的枯草芽孢杆菌为对象,通过建立启动子和信号肽文库,并通过酶的定向进化,实现对酶基因的随机诱变,以期提高和改善酶的性能性质,为其投入工业化生产提供理论依据。最后通过酶学性质的表征,优化酶分子的酶学反应活性。 通过一系列的基因分子操作,以期能大规模的生产TpGUS,避免TpGUS在发酵过程中存在的在酿酒酵母中产率低、发酵周期长和生产成本高的瓶颈问题,对其未来的工业化应用有很重要的意义。

提交时间: 2017-09-20 来自合作期刊:《中国生物工程学会》 点击量383, 下载量27

5. chinaXiv:201709.00099 [pdf]

同步利用葡萄糖和木糖发酵产油脂酵母菌的筛选与鉴定

张艳平; 郭书贤; 王冬梅; 张志立; 李斌
分类: 生物学 >> 生物工程

从河南省南阳地区土壤中分离的10株野生酵母菌株中,筛选到一株能够同步利用葡萄糖和木糖发酵高产油脂的酵母菌株ZZ-46。摇瓶发酵120 h,在葡萄糖:木糖为2:1条件下,生物量、油脂产量、油脂含量、油脂系数和产油速率分别达到20.23g/L、9.89 g/L、48.91%、14.64g/100g和0.083 g•L-1•h-1;该菌株利用5种不同比例混合糖(葡萄糖和木糖)产油脂的脂肪酸组成均以C16和C18系脂肪酸为主,其中油酸含量最高,其次为亚油酸、棕榈酸和硬脂酸,四种脂肪酸含量占总脂肪酸含量的90%以上,与植物油脂脂肪酸组成相似,可以作为生物柴油油源。通过形态特征及26S rDNA D1/D2区域序列分析,初步鉴定菌株ZZ-46为Cutaneotrichosporon dermatis,与Trichosporon dermatis同物异名。

提交时间: 2017-09-20 来自合作期刊:《中国生物工程学会》 点击量244, 下载量23

6. chinaXiv:201709.00100 [pdf]

塑料的生物降解:关键问题及进展

杨宇
分类: 生物学 >> 生物工程

2005 ~ 2017年间,世界塑料年产量从2.3亿吨增长到了4.0亿吨,预计到2050年,世界塑料年产量将达到34亿吨[1]。塑料消费产生的大量塑料废物,只有9%被回收利用,12% 被焚烧,79%被填埋或直接丢弃到环境中[2]。由于稳定的材料特性,塑料废物在自然条件下降解十分缓慢,预计到2050年,垃圾填埋场和自然环境中的塑料垃圾将达到120亿吨[2]。塑料垃圾在环境中的长期大量积累,给生态环境带来的严重污染和威胁,也成为一个全球性环境问题[3]。 随着一些塑料降解微生物或酶的发现,利用微生物或酶对塑料的降解作用,发展塑料污染的环境修复生物技术,已逐渐被意识到是一种解决塑料废物的新途径[4-6]。但是要实现塑料污染的高效生物降解和环境修复,有两大关键问题需要解决:1)塑料降解微生物或酶的来源。自19世纪40年代,塑料开始被人工合成并逐渐应用到生产生活之中,其出现历史不足80年。这么短的时间,被认为还不足以自然进化出广泛的塑料降解微生物或酶。探索自然界来源的塑料降解微生物和酶系统并加以利用,是开发塑料污染环境生物修复技术的重要基础性研究工作。2)塑料生物降解的速率。高分子长链的惰性化学结构单元、高分子链的大分子量和高分子链的聚集态结构等特征是阻碍影响微生物或酶降解塑料效率的重要因素。 针对这两个问题,作者开展了生物工程和高分子物理的交叉研究,取得了一些进展。1)揭示了昆虫及其肠道微生物是塑料分解微生物重要来源。从粮食害虫啮食塑料包装袋的自然现象受到启发,采用同位素示踪及多种物理化学分析技术,首次系统证实了黄粉虫能将PS长链分子解聚并分解为CO2;阐明了肠道微生物种群在塑料降解过程中起决定性作用。从黄粉虫和蜡虫肠道中分离出了降解聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、聚氨酯(PUR)和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的细菌[4-5]。2)发现结晶高分子(如PE、PP和PET)的结晶度是影响生物分解速率的关键。微生物或酶在分解结晶高分子的过程中,优先分解高分子的无定形区,而对于结晶区分解十分缓慢,甚至不能分解[6]。结晶区的分子的堆砌形成的致密结构阻碍了酶残基对分子链的捕获。从高分子结晶热力学原理出发,提出一种不改变分子结构的基础上,实现结晶高分子向无定形的转变的去结晶化的方法,将结晶高分子的生物分解速率提高了100倍[7]。

提交时间: 2017-09-20 来自合作期刊:《中国生物工程学会》 点击量203, 下载量12

7. chinaXiv:201709.00097 [pdf]

Flavobacterium sp. M1-14发酵生产VK2过程的温度与kLα控制策略

吴荷芳; 王鹏; 王晗; 赵根海; 刘会; 王丽; 尉鸿飞; 方雪; 郑之明
分类: 生物学 >> 生物工程

维生素K2(VK2)是一系列具有异戊二烯侧链的甲萘醌类化合物,根据侧链长短不同,以MK-n表示。高活性VK2主要由微生物合成,具有防治骨质疏松症、出血症、肝硬化及帕金森症等疾病的生理功能。黄杆菌是其重要生产菌株,可合成包括MK4,MK5和MK6多种VK2同系物。 我们发现通过调控发酵温度,可以控制黄杆菌合成VK2的同系物类型和产量。在20~37℃范围内,25℃时Flavobacterium sp. M1-14生长最好,生物量达到8.8 g/L,但发酵产物完全是MK6,产量为13.9 mg/L,单位菌体产量1.6 mg/g。当发酵温度高于30℃,黄杆菌可同时合成MK4、MK5和MK6。37℃时,MK4和MK5产量最高,分别为1.6mg/L和1.7mg/L,VK2总量12.5 mg/L,但此时生物量仅5.5g/L,单位菌体产量为2.3mg/g。针对黄杆菌菌体生长和VK2同系物合成的最适温度差异,考虑采用变温发酵提高生物量和VK2产量。经多因素优化后,我们开发出先低温后高温的两段式变温策略,即25℃先发酵48小时,之后转为37℃继续发酵96小时,VK2产量达到20.9 mg/L(其中MK4为2.1 mg/L,MK5为2.3 mg/L、MK6为16.5mg/L),生物量为8.8g/L,单位菌体产量2.4mg/g。 继而,在30L发酵罐上,我们通过控制通气量和转速,考察了不同温度发酵对氧需求情况。发现在25℃和37℃时,黄杆菌发酵合成VK2的最佳kLa分别为360 h-1和60 h-1。针对变温发酵过程中菌体对氧需求的变化,我们开发了两阶段变kLa控制策略。优化后在变温发酵前期24小时kLa为360 h-1,之后120小时kLa 为60 h-1,VK2产量达到28.7 mg/L,(其中MK4为2.8mg/L,MK5为3.4 mg/L、MK6为22.5 mg/L),较起始提高了107%,生物量为15.5 g/L,单位菌体产量1.9 mg/g。 通过变温变kLa分阶段发酵调控策略,可以改变黄杆菌合成VK2的同系物类型,明显提高VK2产量,为实现VK2生物制备的工业化奠定了优化的基础。

提交时间: 2017-09-20 来自合作期刊:《中国生物工程学会》 点击量226, 下载量35

8. chinaXiv:201709.00094 [pdf]

毕赤酵母GPI型细胞壁蛋白的功能分析

王盼; 梁书利; 林影
分类: 生物学 >> 生物工程

毕赤酵母作为常用的蛋白表达系统,广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面,已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中成功地得到表达。在工业酶制剂领域,也有许多酶制剂包括植酸酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等利用毕赤酵母实现了产业化规模的生产[1]。 酵母细胞壁在保护细胞完整性方面起到非常重要的作用,能够维持细胞渗透压平衡,在形态发生过程中产生并维持细胞的形态,并且在环境压力中有保护细胞的作用[2]。细胞壁主要由多糖和蛋白组成,其中多糖为β-1,3-葡聚糖,β-1,6-葡聚糖和几丁质,蛋白主要由N-和O-修饰的蛋白组成,在电子显微镜下观察发现,酵母的细胞壁厚约 200nm,分为电子密度不同的两层结构,外层甘露糖蛋白层和内层葡聚糖骨架[3]。GPI修饰的蛋白是一种通过糖脂共价连接在蛋白C端,从而将蛋白定位在细胞表面的一类蛋白。GPI修饰的蛋白在所有的真核细胞中都存在,并且其基本结构在大部分生物中都是保守的。通过对毕赤酵母全基因组中所有编码的蛋白序列进行分析,结合GPI型细胞壁蛋白的结构特征,最终在毕赤酵母GS115中发现50个潜在的GPI型细胞壁蛋白[4],对这些蛋白的生化分析及功能鉴定需要进一步的探索。 通过对毕赤酵母GS115潜在的50个GPI细胞壁蛋白逐一进行单基因敲除,构建了GPI型细胞壁蛋白缺陷菌株库,研究了各细胞壁缺陷菌株在不同浓度碳源条件下的生长情况及细胞形态变化,以及细胞表面亲疏水变化及对细胞壁干扰剂的耐受性情况。研究发现敲除细胞壁蛋白会引起细胞多方面的变化,如对不同碳源的利用差异,对不同细胞壁干扰剂的耐受差异等。挑取一株甲醇耐受的菌株进行转录组学的分析,发现敲除后细胞代谢路径发生了明显变化,如细胞壁各组分的合成路径,细胞膜甾醇合成路径相关基因明显上调,同时一些胁迫路径也被激活,以抵抗高浓度甲醇对细胞的损害。通过对细胞壁蛋白功能进行深入的研究,将为毕赤酵母作为宿主菌表达外源蛋白提供重要的参考价值。

提交时间: 2017-09-20 来自合作期刊:《中国生物工程学会》 点击量207, 下载量12

9. chinaXiv:201709.00087 [pdf]

微生物燃料电池中高活性产电微生物的筛选 鉴定、产电性能强化及其电子传递机制的研究

骆健美
分类: 生物学 >> 生物工程

微生物燃料电池(Microbial Fuel Cells, 简称MFCs)是一种利用产电微生物作为催化剂,将有机物(无机物)中的化学能直接转化为电能的生物反应器,在生物产能和处理废水方面具有广阔的应用前景。 课题组以天津泰达污水处理厂的污泥为接种物,启动并运行MFCs。从阳极富集的生物膜上分离得到了多个分离株。其中,分离株P2-A-1和P2-A-5表现出较高的电化学活性,经鉴定后分别归属于Tolumonas osonensis 和Kocuria rhizophila,这是该种属微生物产电性能的首次报道。除了产电条件的优化,细胞的通透化处理是提高MFCs输出功率的有效手段,化学剂处理增加了菌体对电极的粘附效率,降低了MFCs内阻,增大了细胞通透性和细胞膜流动性,增加了关键电子载体CoQ10含量。通过构建膜包裹型MFCs、阳极液的循环伏安扫描及GC-MS成分分析,明确菌株的胞外电子传递机制。以模式产电微生物铜绿假单胞菌为对象,利用全局转录机制工程将系列内源和外源全局转录因子导入铜绿假单胞菌,利用代谢工程的思路,强化胞内电子的产生和胞外电子的传递,探讨高产电活性工程菌株的构建新策略和新方法。其中,外源全局转录因子IrrE的导入能显著提高铜绿假单胞菌的产电性能和环境压力耐受性。进一步分析发现,该转录因子的导入对中心代谢途径相关基因、生物膜相关基因、中介体合成相关基因、群体感应系统以及一般胁迫响应相关基因等的表达水平产生明显的影响。说明IrrE在宿主生物中发挥着全局调控作用。课题成果对于丰富产电微生物的多样性,提高微生物燃料电池的输出功率具有重要的意义。

提交时间: 2017-09-20 来自合作期刊:《中国生物工程学会》 点击量200, 下载量14

10. chinaXiv:201709.00088 [pdf]

毕赤酵母核糖体蛋白对蛋白质过量表达的调控

廖锡豪; 林影
分类: 生物学 >> 生物工程

蛋白质过量表达的调控研究中,关于基因转录、蛋白质修饰、折叠和分泌途径的分子机理研究及其在蛋白合成调控中的应用已经较为广泛。由于核糖体结构存在复杂性,关于蛋白质过量表达在核糖体翻译水平的研究及调控的报道较少。 毕赤酵母作为蛋白质表达和生产的重要工业菌株,已成为蛋白质高效表达调控研究的重要对象。在过去的研究中通过选择高效启动子提高蛋白质基因转录水平,过量表达内源UPR相关因子提高蛋白质折叠水平,优化分泌信号肽均能达到提高蛋白质合成与表达量的目的。前期研究在蛋白质过量表达的毕赤酵母细胞中发现了大量核糖体蛋白表达下调及细胞生长下降的现象,对核糖体蛋白及核糖体结构功能进行深入分析,有望从翻译水平上研究核糖体蛋白对细胞蛋白质过量表达的分子调控机理。 本课题使用iTRAQ LC-MS/MS技术分析重组毕赤核糖体蛋白及能量代谢途径的差异表达,发现在过表达木聚糖酶过程中有30个核糖体蛋白出现下调。对表达下调的核糖体蛋白进行基因缺失构建毕赤酵母突变菌株,通过Cre/loxp筛选标记可重复利用基因敲除系统在毕赤酵母GS115宿主中进行核糖体蛋白突变菌株的筛选及功能研究,成功获得了RPL22∆、RPL24∆、RPL26∆等28个核糖体蛋白突变菌株。分别以增强型绿色荧光蛋白egfp及植酸酶phy作为报告蛋白,初步分析突变株的细胞生长特性与蛋白质合成效率,并测定分析了其多聚核糖体图谱,结果表明缺失核糖体蛋白对细胞生长与蛋白质过量表达有不同程度的影响,且可使细胞翻译活性大幅下降。结合翻译组学和蛋白质新生肽链折叠稳定性分析,研究结果表明非必需核糖体蛋白缺失影响核糖体对蛋白质的翻译起始速率与延伸速率,进而影响蛋白质共翻译折叠效率,从蛋白质的合成质量上调控其产量,为进一步分析核糖体蛋白对翻译、内质网胁迫耐受及蛋白合成分泌等功能的影响和深入探讨核糖体蛋白对重组毕赤酵母细胞生长及蛋白质过量表达的分子调控机制提供基础。

提交时间: 2017-09-20 来自合作期刊:《中国生物工程学会》 点击量201, 下载量15

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