分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力，从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成：Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合体，Cas9-sgRNA复合体中sgRNA的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合，Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行切割。与传统的基因组编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统具有几大明显的优势：易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以及衍生出来的CRISPRi和CRISPRa基因表达调控技术已经被广泛应用于多种真核和原核生物中。该文综述了CRISPR/Cas9系统的起源、作用机理、在生物体中的应用和其衍生出的技术，并概述了其脱靶效应和未来前景。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮（Ⅳ）是生产9-氟甾体激素的关键前体，以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯（Ⅰ）为底物合成Ⅳ是工业化生产Ⅳ的重要方法。通过比较分枝杆菌全细胞转化法与细胞裂解液转化法，发现分枝杆菌全细胞只能将Ⅰ转化9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮（Ⅱ），而细胞裂解液可以有效地将Ⅰ转化为Ⅳ，其反应机制为底物Ⅰ自发水解为中间体Ⅱ，Ⅱ在C1,2位脱氢酶（KSTD）的催化作用下发生C1,2位脱氢反应生成产物Ⅳ。为进一步提高产物Ⅳ的生成率，利用基因工程手段在分枝杆菌中分别过表达编码KSTD的关键基因：kstD、kstD3和kstDM，提高脱氢反应效率，结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH 7.0的重组菌株MS136-kstDM细胞裂解液中反应45 h，Ⅳ的生成率为78.4 %，比出发菌株提高了38.9％；并优化缓冲液pH，提高反应速率，结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH 7.5的重组菌株MS136- kstDM细胞裂解液中反应45 h，Ⅳ的生成率为92.8 %，比出发菌株提高了63.4 %。
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