匍枝根霉纤维二糖合成酶胞内糖基供体的初探及结构功能研究

摘要: 纤维二糖可有效诱导丝状真菌产纤维素酶，前期研究表明匍枝根霉Rhizopus stolonifer TP-02具有纤维二糖合成酶（CBS），可以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）为糖基供体合成纤维二糖，从而开启纤维素酶的自诱导合成途径。为研究R. stolonifer中纤维二糖的胞内合成途径，通过重叠PCR在GDP-葡糖焦磷酸化酶基因ggp中引入硫胺吡啶抗性基因ptrA，分别转化原菌TP-02和△ugp突变株，构建△ggp和△ugp/△ggp突变株。利用液质联用（LC-MS）检测突变株的胞内糖组分，发现ggp的缺失对胞内纤维二糖合成的影响较弱，而同时缺失ugp则将直接导致二糖合成受阻。RT-qPCR结果显示△ggp突变株中纤维素酶基因转录水平较原株TP-02下调20%左右，而△ugp/△ggp突变株中被测基因的转录水平则出现了高达80%左右的下调。同时对突变株纤维素酶表达水平进行研究，发现△ugp/△ggp突变株中几乎检测不到纤维素酶活力。结果显示，UDPG为R. stolonifer胞内合成纤维二糖的主要糖基供体，而GDPG可能是UDPG的替代物，在UDPG不足时维持胞内二糖合成。此外，利用生物信息学方法对CBS结构功能深入分析，经丙氨酸扫描确定其合成纤维二糖的关键作用残基为Asp210和Asp300，为后续进一步研究及理性改造提供方向和理论依据。