信号肽对亮氨酸脱氢酶在B.subtilis中分泌表达的影响及酶学性质研究

摘要: 根据信号肽N端电荷数，选择Sec及Tat两种途径的信号肽构建枯草芽孢杆菌穿梭质粒，首次实现Bacillus cereus源亮氨酸脱氢酶基因在Bacillus subtilis中的分泌表达。Tat途径信号肽PhoD促进蛋白分泌的效果最好，胞外酶活力达20.25U/ml，为不添加信号肽的2.2倍，信号肽N端较多的电荷数，可能有利于多聚体蛋白的分泌。对表达产物进行纯化和酶学性质测定。结果表明，纯酶比酶活为13U/mg；L-Leucine为底物时酶的Km为6.17mM，Vmax为14.49umol·min-1·mg-1；底物特异性研究发现，酶与天然底物L-Leucine的亲和性最好，对一些脂肪族氨基酸也有活性，对芳香族氨基酸L-Phenylalanine无活性；酶的最适pH为10.5~12，pH稳定范围为5.0-11.0；最适反应温度为55℃；圆二色谱变温扫描酶二级结构变化，α螺旋含量随温度升高逐渐降低；差示扫描微量热技术(DSC)测定酶的解折叠温度（Tm值）为64.13℃，表明该酶具有较好耐热性。