筛选标记循坏利用质粒在毕赤酵母中的应用

摘要: 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是近年来发展迅速的一种高效表达的宿主菌。毕赤酵母属甲醇营养型酵母，具有操作简便、易于高密度培养、生长迅速、对翻译后的蛋白进行加工、生产成本低等优点。毕赤酵母表达系统已有20多年的研究开发使用历史，有多种表达载体和改良的宿主菌可供选择，可进行胞内表达或分泌表达。利用基于同源重组的DNA转化系统将基因整合进基因组是目前最重要的基因编辑手段之一，已经被广泛应用于毕赤酵母中；但毕赤酵母面临着筛选标记不足的难题。 在Cre/loxP系统中，当两个loxP位点以顺时针相同的方向放在一段序列之间时，Cre酶能识别并切除该序列，留下一个loxP位点。当使用突变的loxP序列（例如lox71和lox66），当被Cre重组酶识别并进行作用后，会留下一个新的突变的lox72位点，并不会与下次引入的loxP位点进行作用，从而避免了残留的loxP位点与新引入的loxP位点被Cre重组酶识别的可能。 本文通过在毕赤酵母通用质粒pPICZA和pGAPZA的基础上，在博来霉素抗性基因表达盒后融合了诱导表达Cre的表达盒，并在这两个表达盒前后引入了lox71和lox66位点，分别构建了质粒pZACH和pGACH；进而进行筛选标记循坏利用。具体过程如下：1、质粒转化毕赤酵母，使用博来霉素进行抗性筛选得到阳性转化子；2、将阳性转化子接种于含有诱导剂甲醇的YPM培养基中，培养过夜；3、将培养过夜的含菌体的培养基划线于不含抗生素的YPD平板上，培养至酵母单菌落可见；4、将3中的酵母单菌落同时点种于不含抗生素的YPD平板和含博来霉素的YPDZ平板上，如能在YPD平板上生长而不能在YPDZ平板上生长，则说明该菌落的博来霉素抗性表达盒已丢失，再使用PCR鉴定进行验证。整个抗性素标记丢失需要约4-5天。 使用质粒pZACH分别在毕赤酵母中表达了来源于柠檬酸杆菌（Citrobacteramalonaticus）CGMCC 1696的植酸酶和来源于抗辐射不动杆菌（Acinetobacterradioresistens） CMC-1的脂肪酶，这些质粒的抗性素标记丢失效率均大于70%，而且植酸酶和脂肪酶的产量与菌体生长都和使用基础质粒pPICZA进行表达的结果相似。该质粒对外源蛋白表达以及菌体生长并无不良影响。 使用筛选标记循坏利用质粒pZACH和pGACH，可以克服毕赤酵母中筛选标记不足的缺点，便于更好地在毕赤酵母中进行基因改造，从而为毕赤酵母的进一步工业应用提供基础。