人源Alu RNA工程菌的构建和表达

摘要: 目的：外源RNA导入细胞特异性上调或下调基因表达，目前外源RNA的制备方法主要有化学合成，体外转录，细胞提取。Alu DNA和Alu RNA是人基因组和转录组中最重要的成分，参与基因表达调节。建立工程菌制备基因工程人源Alu RNA （Alu RNA）的技术，所提取的RNA满足一般生物学实验要求。方法和结果：将人Alu序列插入pET-28α质粒 （pET），转化BL-21菌，探讨不同条件对Alu RNA产生的影响。用pET-Alu×8质粒转化BMBL-21（DE3）感受态细胞（简称DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导减弱细菌生长；用IPTG诱导2，4，6，8，10，12，14和16小时，用northern杂交检测Alu RNA的量，发现诱导4小时RNA产量最高；1，2，4，8，14拷贝的Alu序列插入pET，转化DE3菌，随拷贝数增加Alu RNA产量上升；pET-Alu×8 DE3菌液，不加IPTG诱导，没有Alu RNA产生，0.1-0.4 mg / ml IPTG诱导时，Alu RNA产量没有区别，偏离该浓度时，RNA产量略下降；34 ℃，37 ℃和40 ℃培养pET-Alu×8 DE3菌液，IPTG诱导4小时，在37 ℃培养条件下，RNA产量最高；将pET-Alu×8质粒转化3种BL-21感受态细胞，包括DE3，BMBL21-DE3-pLysS（简称pLysS）和Trans BL 21（简称TransBL），发现转化DE3感受态细胞后Alu RNA产量最高。结论：本文中建立了基因工程制备Alu RNA的技术：pET-Alu×14 质粒转化DE3菌，37 ℃培养至600 nm OD 1.0时，加入终浓度为0.2 mg/ml IPTG诱导4小时，获得最高Alu RNA产量，纯Alu RNA在提取的RNA中的含量达15.8 %，每100 ml菌液纯Alu RNA产量平均为0.46 mg。